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Thesis etd-09142021-181235


Thesis type
Tesi di specializzazione (4 anni)
Author
FONNESU, ROSSELLA
URN
etd-09142021-181235
Thesis title
Screening High Content nella ricerca di nuovi composti antivirali
Department
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Course of study
MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA (non medici)
Supervisors
relatore Lai, Michele
Keywords
  • Pailmitoiletanolamide
  • High throughput screening
  • SARS-CoV-2
Graduation session start date
30/09/2021
Availability
Withheld
Release date
30/09/2091
Summary
La pandemia COVID-19 ha causato ad oggi più di 200 milioni di casi e più di 4,5 milioni di morti sulla popolazione globale, ed è causata dall’agente infettivo SARS-CoV-2 un β-coronavirus. Questo nuovo coronavirus è un patogeno zoonotico, probabilmente originatosi dai pipistrelli e trasmesso all’uomo tramite un ospite intermedio.
SARS-CoV-2 fa parte dei coronavirus altamente patogeni che causano patologie respiratorie gravi, in cui il danno polmonare è mediato sia dalla replicazione virale che dalla risposta infiammatoria e immunitaria che sono gravemente compromesse.
Il meccanismo di ingresso di SARS-CoV-2 avviene prevalentemente per endocitosi, attraverso il legame tra l’anti-recettore virale Spike ed il recettore cellulare ACE2,
La campagna vaccinale in corso, basata prevalentemente sulla somministrazione di BNT162b2 (Pfizer) e mRNA-1273 (Moderna) ha dimostrato di prevenire efficacemente il COVID-19. Tuttavia, l’emergenza di nuove varianti e lo scarso accesso ai vaccini nei paesi in via di sviluppo, rendono necessaria la ricerca di nuovi composti antivirali contro SARS CoV-2. Al momento la terapia farmacologica contro l’infezione mira a controllare i sintomi e l’eccessiva attivazione del sistema immunitario nei pazienti.
Nel presente lavoro abbiamo contribuito a caratterizzare l’azione antivirale di un composto dalle spiccate attività antinfiammatorie e anti-nocicettive, la Palmitoiletanolamide. La Palmitoiletanolamide è ad oggi è stata proposta in letteratura per il trattamento del danno polmonare acuto e in patologie neurologiche infiammatorie causati dal COVID-19.
Da analisi preliminari di docking molecolare è emerso che la Palmitoiletanolamide si lega ad ACE2 e alla Spike, in particolare nel sito di interfaccia tra le due molecole.
Questo legame può potenzialmente avere un effetto di riduzione dell’infettività di SARS-CoV-2, quindi abbiamo deciso di testare l’efficacia della Palmitoiletanolamide in un modello cellulare in vitro.
I nostri risultati hanno dimostrato che basse concentrazioni di Palmitoiletanolamide siano efficaci nel ridurre la replicazione virale di SARS-CoV-2, sia per il ceppo wild type che per la variante Delta. Inoltre, tramite l’utilizzo del sistema Operetta® High Content Imaging è stato possibile quantificare la differenza nel numero di cellule infettate da SARS-CoV-2 a seguito del trattamento con la Palmitoiletanolamide.
Dato il ruolo di questa molecola nella regolazione del metabolismo lipidico operata tramite l’attivazione del recettore nucleare PPAR-α, e in particolare nell’attivazione della lipolisi, abbiamo voluto quantificare se la somministrazione esogena di Palmitoiletanolamide avesse tale effetto in vitro. Tramite microscopia confocale abbiamo visualizzato il numero di vescicole lipidiche contenute nel citoplasma di cellule non trattate e trattate con la Palmitoiletanolamide, osservando una riduzione significativa di queste.
Questo dato è rilevante in quanto SARS-CoV-2 come altri virus a RNA, localizza la replicazione all’interno di tali vescicole.
Abbiamo voluto poi misurate quanto l’effetto di riduzione del numero di cellule infette causato dalla Palmitoiletanolamide fosse riconducibile al suo legame con ACE2 o Spike e quindi all’inibizione dell’entrata di SARS-CoV-2. Tali esperimenti sono stati fatti utilizzando un vettore lentivirale pseudotipizzato esprimente la proteina Spike, utilizzato per trasdurre cellule suscettibili, in presenza o in assenza di Palmitoiletanolamide.
Queste condizioni sperimentali hanno ricondotto ad una riduzione del numero di cellule trasdotte, concordante con i risultati ottenuti precedentemente.
Possiamo quindi concludere che la Palmitoiletanolamide è una molecola da tenere in considerazione per il trattamento di SARS-CoV-2, per il suo duplice ruolo di antivirale e di modulatore del sistema immune e infiammatorio.
Studi successivi saranno necessari per comprendere meglio il meccanismo di azione di questa molecola e ottimizzare un sistema di somministrazione applicabile in vivo.
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