• WDR62
• primary microcephaly
• microcefalia primaria
• cellule isogeniche iPS
• WDR62
• isogenic iPS cells

RIASSUNTO: Il cervello è un organo dalla struttura e funzione altamente complesse. La parte più esterna – la neocorteccia – è costituita da diverse popolazioni neuronali interconnesse e organizzate in sei strati (I-VI). Alla formazione di questa rete neuronale concorrono diversi pathway molecolari che, durante il neurosviluppo, controllano gli eventi di proliferazione, migrazione cellulare e differenziamento. L’alterazione di questi meccanismi può dar luogo ad un gruppo eterogeneo di disturbi complessi definiti malformations of cortical development (MCDs). La microcefalia, che appartiene a questa categoria, è caratterizzata da una diminuzione della circonferenza occipito-frontale del soggetto di due o tre deviazioni standard al di sotto della media per età, sesso ed etnia. Questa patologia può essere determinata sia da fattori genetici che ambientali. Ad oggi, sono stati identificati venticinque loci genici associati all’insorgenza di questo disordine, classificati da MCPH1 a MCPH25. In particolare, MCPH2, la seconda forma più comune di microcefalia primaria (14.1% dei casi), è causata da mutazioni a carico del gene WDR62 (WD repeat domain 62), localizzato sul cromosoma 19. WDR62 codifica per una proteina implicata nella stabilizzazione del fuso mitotico (durante la fase M si localizza ai poli del fuso), nella progressione del ciclo cellulare e nel mantenimento del pool dei progenitori neurali.
In questo lavoro di tesi abbiamo indagato una particolare mutazione (D955AfsX112) a carico di WDR62. Tale mutazione consiste nella delezione di 4 bp a livello dell’esone 23 che determina la formazione di un codone di STOP prematuro e quindi la produzione di una proteina tronca. Il fenotipo cellulare derivante consiste in una de-localizzazione della proteina ai poli del fuso durante la mitosi. La finalità di questo lavoro di tesi è stata la generazione di una linea isogenica retromutata mediante il sistema CRISPR/Cas9, a partire da cellule pluripotenti indotte (iPS) già derivate dal paziente affetto. Grazie a questa tecnologia di genome editing, è stato possibile ripristinare con successo la sequenza corretta nel gene mutato. Nelle linee clonali retromutate è stato verificato anche il ripristino della localizzazione di WDR62 a livello dei poli del fuso in fase M. Per verificare gli effetti della mutazione WDR62 su una popolazione neurale rilevante, rispetto al controllo isogenico, è stato applicato alle cellule iPS (sia mutate che corrette) un protocollo di differenziamento mediante “Dual SMAD inhibition”. Durante il processo di differenziamento sono state ottenute diverse tipologie cellulari, quali cellule staminali neuroepiteliali (NES), che neuroni corticali maturi. Mediante tecniche di immunofluorescenza confocale abbiamo misurato l’indice mitotico dei diversi progenitori neurali e quantificato le diverse popolazione neuronali a tre diversi time point: Day in vitro (DIV) 16, DIV40 e DIV80. Sulle cellule NES è invece stata effettuata un’analisi del ciclo cellulare e dell’indice mitotico.
L’applicazione del genome editing alle cellule iPS derivate da paziente, ha offerto la possibilità di un’analisi approfondita sulle conseguenze della mutazione a carico di WDR62 a livello di progenitori neurali e il suo impatto sul neurosviluppo.

ABSTRACT: The brain is an organ characterized by an extremely complex structure and countless functions. Its outermost part, the neocortex, is composed by several interconnected neuronal populations organized in six layers (I-VI). A plethora of different molecular pathways contribute to neuronal network formation during neurodevelopment regulating proliferation, cell migration and differentiation. Alterations of these mechanisms can lead to a heterogeneous group of disorders identified as malformations of cortical development (MCDs). Microcephaly, which belongs to this category, is characterized by the reduction of the occipital-frontal circumference more than two or three standard deviations below the ethnically, age and sex-matched control. Its etiology can be determined by genetic or environmental factors. To date, twentyfive loci have been identified related to the onset of the disorder and classified from MCPH1 to MCPH25. In particular, MCPH2, the second most common form of primary microcephaly (14.1% of cases), is caused by recessive mutations in WDR62 (WD repeat domain 62), located on chromosome 19. WDR62 encodes for a protein involved in mitotic spindle stabilization (during the M-phase it localizes at spindle poles), in cell-cycle progression and in neural progenitor pool maintenance.
In this thesis work, we investigated a particular mutation (D955fs112) of WDR62. The latter is caused by a 4 bp deletion in exon 23, resulting in a premature STOP codon that leads to a truncated peptide formation. The cellular phenotype consists in WDR62 mis-localization from the spindle poles during mitosis. Our purpose was to generate an isogenic line through CRISPR/Cas9 system, starting from induced pluripotent stem cells (iPS), already derived from the affected patient. Thanks to this genome-editing technique, it has been possible to successfully restore the altered gene sequence. In the isogenic cell line, we further verified the correct WDR62 localization at the level of spindle poles during mitosis. In order test the effects of WDR62 mutation on a relevant neuronal population, in comparison to the isogenic, we applied to iPS cell lines (both mutated and restored) a differentiation protocol through “Dual SMAD inhibition”. During the differentiation process, we obtained several cell types, including neuroepithelial stem cells (NES) and mature neocortical neurons. By immunofluorescence and confocal imaging, we measured mitotic index of neural progenitor populations and quantitatively analyzed different neuronal sub-populations at three different time points: Day in vitro (DIV) 16, DIV40 and DIV80. On NES cells, on the other hand, we carried out cell cycle analysis and mitotic index measurement.
The application of genome editing to patient-derived iPS cells offers the possibility of an in-depth analysis about the consequences of WDR62 mutations on neural progenitors and its impact on neurodevelopment.