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Uno degli enzimi chiave del metabolismo degli aminoacidi a catena ramificata (leucina, isoleucina e valina) è la proteina BCAT ("branched chain aminotrasferase", aminotrasferasi degli aminoacidi ramificati). Di questo enzima si conoscono due isoforme: una citosolica (BCATc), principalmente espressa nel sistema nervoso, ed una mitocondriale (BCATm), presente in un maggior numero di tessuti. Nel corso di recenti studi, nel nostro laboratorio abbiamo dimostrato che l'espressione del gene BCATc è regolata dal fattore neurotrofico BDNF ("Brain-derived Neurotrophic Factor") in seguito alla lesione della corteccia visiva in ratti neonati. E' noto infatti che questa lesione determina la morte quasi completa dei neuroni del nucleo genicolato laterale dorsale (che proiettano alla corteccia visiva), e che la somministrazione intraoculare di BDNF è in grado di prevenire questo processo degenerativo. Nel tentativo di spiegare i meccanismi molecolari della neuroprotezione mediata da BDNF, abbiamo osservato che BDNF determina la sovra-espressione del mRNA di BCATc nel nucleo genicolato.
Lo scopo del mio lavoro di tesi era quello di analizzare in maggior dettaglio l'espressione di BCATc nel cervello e la sua regolazione da parte di BDNF. In particolare, ho analizzato l'espressione di questo gene durante lo sviluppo embrionale e post-natale del cervello del topo e nel cervello di topi transgenici per BDNF.
Per poter effettuare questi studi di espressione, inizialmente ho clonato la sequenza del cDNA di BCATc murino. Il cDNA completo è stato amplificato mediante RT-PCR ("reverse transcription-polymerase chain reaction") a partire da RNA totale di ippocampo di topo, utilizzando oligonucleotidi disegnati in base alla sequenza presente nella "Genbank". Il cDNA amplificato è stato quindi clonato in un plasmide batterico che permette di preparare sonde ad RNA antisenso.
La regolazione dell'espressione di BCATc da parte di BDNF è stata studiata utilizzando topi transgenici che esprimono il gene di BDNF sotto il controllo del promotore per la calcio-calmodulina chinasi II (CaMKII). In questi animali, BDNF viene sovraespresso nel telencefalo (corteccia cerebrale, ippocampo e gangli della base) a partire dalla prima settimana di vita post-natale. Mediante esperimenti di ibridazione in situ non radioattiva con una sonda ad RNA antisenso per BCATc su sezioni sagittali e coronali di cervello, ho osservato che BCATc è sovraespresso nell'ippocampo ed in alcune aree della corteccia cerebrale di topi adulti transgenici per BDNF (tgBDNF) rispetto ad animali di controllo "wild type" (wt). La conta stereologica delle cellule BCATc-positive su queste sezioni potrà fornire dati quantitativi più dettagliati sull’espressione di BCATc nei due diversi genotipi. L’espressione di BCATc è stata inoltre monitorata mediante RT-PCR semiquantitativa su RNA di ippocampo e corteccia cerebrale di animali wt e tgBDNF. I risultati preliminari di questi esperimenti sembrano confermare che BCATc è sovraespresso nell’ippocampo dei topi transgenici per BDNF. Questi dati suggeriscono quindi che l'espressione del gene BCATc sia regolata dall'azione del fattore neurotrofico BDNF in specifiche strutture del cervello del topo.
L'analisi dell’espressione di BCATc durante lo sviluppo embrionale e post-natale è stata condotta mediante ibridazioni in situ non radioattive su sezioni di embrioni a diversi stadi di sviluppo e su sezioni di cervello di topo a diverse età di vita post-natale. Al dodicesimo giorno di gestazione (E12.5), la marcatura dell'mRNA di BCATc appare diffusa a tutto il telencefalo e nel romboencefalo. Allo stadio embrionale E14.5, la marcatura a livello degli emisferi cerebrali è sempre evidente, ma appaiono ben marcati anche i nuclei del rafe ed il fascio longitudinale mediale del romboencefalo. Lo strato granulare esterno del cervelletto risulta marcato in maniera specifica a partire dallo stadio embrionale E16.5; a questo stadio si osserva anche la comparsa della marcatura a livello dell'ippocampo, che risulterà ben più evidente alla nascita (P0). Al ventunesimo giorno di vita post-natale (P21) ed in topi adulti il messaggero di BCATc è espresso negli emisferi cerebrali (principalmente negli strati più profondi), nell'ippocampo, nei nuclei reticolari del talamo, nel cervelletto, nei nuclei del rafe ed in altri nuclei del romboencefalo. Il profilo di espressione osservato suggerisce che BCATc sia espresso principalmente in neuroni del sistema GABAergico inibitorio e del sistema serotoninergico. A questo proposito sarà interessante effettuare esperimenti di doppia marcatura che permettano di mettere in evidenza la localizzazione del mRNA di BCATc in specifche popolazioni di neuroni (es. GABAergici, serotoninergici).