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Tesi etd-09132015-165754


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
PASSALACQUA, ILARIA
URN
etd-09132015-165754
Title
Valutazione degli effetti dell'ablazione del gene ASAH1 in cellule di melanoma umano invasivo
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI E INDUSTRIALI
Supervisors
relatore Prof. Pistello, Mauro
Parole chiave
  • CRISPR/Cas9
  • Ceramidasi
  • Ceramide
  • ASAH1
  • melanoma
Data inizio appello
19/10/2015;
Consultabilità
Secretata d'ufficio
Data di rilascio
19/10/2085
Riassunto analitico
Il melanoma maligno (MM) è un tumore della pelle molto aggressivo, caratterizzato da una prognosi spesso molto negativa e da una bassa risposta ai trattamenti chemioterapici . Questa neoplasia può originarsi sia dai melanociti della cute (melanoma cutaneo, MMC), che da quelli delle mucose (melanoma maligno mucosale, MMM). Può formarsi de novo oppure presentarsi a livello di un nevo cutaneo melanocitico congenito e solo in rarissimi casi, direttamente in forma metastatica senza apparenti lesioni cutanee. Il melanoma costituisce ad oggi una delle neoplasie più frequenti al mondo: al quinto posto tra uomini e al sesto tra le donne e comprende il 65% delle morti per cancro alla pelle.
Nonostante l'introduzione di nuovi metodi per la diagnosi precoce del melanoma cutaneo, il tasso di mortalità negli ultimi anni è rimasto sostanzialmente invariato sia a causa dell'alto indice metastatico, sia per l'assenza di cure efficaci per il trattamento della malattia in questa fase.
La ricerca di nuovi farmaci per trattare questa forma tumorale ha evidenziato negli ultimi anni una serie di nuovi bersagli terapeutici. Tra questi è stato individuato un enzima lisosomiale che scinde la ceramide, un lipide di membrana, in sfingosina e acidi grassi: la Ceramidasi Acida (AC). La AC risulta avere un ruolo molto importante in pathway di tipo apoptotico, infiammatorio e di senescenza cellulare ed è estremamente coinvolto nei meccanismi di proliferazione e nel differenziamento delle cellule tumorali. Risulta chiaro quindi il ruolo cruciale delle ceramidi nel bilanciamento delle vie molecolari implicate nel mantenimento delle cellule neoplastiche. Inibitori della AC scoperti recentemente, hanno dimostrato ridurre drasticamente l'attività dell'enzima su diverse linee cellulari tumorali con conseguente aumento delle ceramidi e diminuizione delle sfingosine cellulari. Non sono ancora ben noti i meccanismi molecolari all'interno di cellule con attività ceramidasica ridotta o nulla. Lo scopo di questa tesi è stato quindi quello di valutare gli effetti dell'ablazione del gene che codifica per la ceramidasi acida 1 (ASAH1) su linee cellulari di melanoma invasivo umano.
La delezione del gene ASAH1 è stata effettuata tramite l'utilizzo del sistema CRISPR/Cas9, nuova frontiera del gene editing, su linee cellulari A375 di melanoma maligno e confermata da reazioni di PCR e di sequenziamento.
La selezione dei cloni difettivi per la ceramidasi, è stata effettuata per diluizione limitante dopo il sorting e ogni clone è stato caratterizzato genomicamente utilizzando RT-PCR, sequenziamento e misurazione dei livelli di ceramide.
I cloni difettivi di AC hanno mostrato un tasso di proliferazione estremamente ridotto, una concentrazione di ceramidi intracellulari sedici volte superiore a quella dei controlli e la riduzione di caratteristiche di invasivita’ tipica di queste cellule quali la formazione di colonie in soft agar ed in invasion assays, indicando un ruolo importante delle ceramidi non solo nell’induzione dell’ apoptosi ma anche nella regolazione del ciclo cellulare. Nei cloni difettivi in omozigosi abbiamo osservato l’inizio del percorso apoptotico dopo cinque giorni dal trattamento. Il 25% della popolazione clonale è risultato positivo allo staining con ApoBRDU Tunel Assay e ApoMark Assay, rivelando la presenza di corpi apoptotici. Ne abbiamo studiato inoltre il ciclo cellulare mediante analisi al FACS, marcando le cellule con ioduro di propidio. Il risultato ha mostrato che solo il 4% delle cellule trattate riesce ad entrare in fase G2, contro il 25% delle cellule non trattate.
Per capire in dettaglio quali meccanismi molecolari possano portare alla risposta osservata, abbiamo deciso di studiare l’espressione di un pannello di geni che coprisse tutte le vie apoptotiche. Il risultato ha mostrato un overespressione delle proteine TNF, dell’actina e di MCL1 e la downregolazione dei geni TRAF2, MYC, AKT1. Da questi dati si evince come l’ablazione del gene ASAH1 causi una perturbazione nella biologia cellulare del melanoma che risponde all'aumento dei livelli di ceramidi in vari modi: una parte della popolazione clonale va in apoptosi, una viene bloccata in G1 e l’altra, anche se ridotta, continua il ciclo cellulare. Il rallentamento del ciclo cellulare ci ha portato a pensare che potesse instaurarsi senescenza, evidenziata mediante X-GAL staining, FACS e pannelli di espressione genica in cui il gene MITF risulta down-regolato. I cloni negativi sono stati trattati con chemioterapici, ottenendo una netta diminuizione della proliferazione cellulare con trattamenti di metotrexato e 5-fluoro-uridina a dimostrazione che l'assenza di AC aumenta l'effetto terapeutico dei farmaci antitumorali.
I dati raccolti confermano il ruolo cruciale del gene ASAH1 e quindi del pathway della ceramidasi acida nella biologia delle cellule di melanoma, e la crescente importanza di nuovi composti che andando a inibire questa via, possano diventare adiuvanti nel trattamento del tumore con chemioterapici.
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