• modulatori allosterici
• recettore cb2
• sistema endocannabinoide

Il sistema endocannabinoide (ECS) è un complesso sistema neuromodulatorio ubiquitario, ampiamente distribuito nel sistema nervoso centrale e periferico e svolge un importante ruolo nel controllo di diverse funzioni fisiopatologiche. Quando si parla di ECS si intende l’insieme dei suoi recettori, principalmente i recettori cannabinoidi (CBRs, CB1 e CB2) accoppiati a proteine G, dei suoi mediatori endogeni, gli endocannabinoidi (ECs), che includono l’anandamide (AEA) e il 2-arachidonoilglicerolo (2-AG), e degli enzimi deputati alla loro sintesi (come NAPE-PLD e DAGL), degradazione (FAAH e MAGL) e trasporto (EMT). I recettori CB1 si trovano espressi principalmente nel sistema nervoso centrale e sono coinvolti nella regolazione dei meccanismi che stanno alla base di disturbi mentali, obesità, sclerosi multipla e dolore. I recettori CB2 si trovano maggiormente espressi in cellule associate al sistema immunitario, dove controllano la migrazione cellulare e il rilascio di citochine, in misura minore sono presenti anche nel sistema nervoso centrale, in particolare nella microglia; la loro attivazione ha principalmente effetti antiinfiammatori e immunomodulatori, oltre ad avere un’importante azione analgesica. Data l’ampia distribuzione dei CBRs e il loro vasto coinvolgimento in numerosi effetti fisiologici, la ricerca si è concentrata in un primo momento sulla sintesi di molecole che avessero come target il sito ortosterico, ovvero quello a cui si legano i ligandi endogeni, nel caso specifico gli ECs. Tuttavia, questo tipo di modulazione diretta dei recettori CB1 e CB2 porta a effetti collaterali psicotropi e immunosoppressivi non trascurabili, dovuti rispettivamente al CB1 e al CB2. I limiti derivanti dall’uso di ligandi ortosterici possono essere superati mediante l’utilizzo di ligandi allosterici, ovvero molecole in grado di interagire con un sito del recettore spazialmente distinto da quello dell’ortosterico; a seguito del loro legame al sito allosterico si determina un cambiamento conformazionale in grado di modulare l’efficacia e/o l’affinità del ligando ortosterico. L’interesse verso i modulatori allosterici nasce come conseguenza dei numerosi vantaggi che presentano:
-Segnalazione selettiva temporale e spaziale: esercitano i loro effetti solo nei tessuti dove sono presenti i ligandi endogeni e non competono con essi per il sito ortosterico. Pertanto, sono in grado di mantenere le caratteristiche temporali e spaziali del segnale endogeno.
-Maggiore specificità per il sottotipo recettoriale: le sequenze dei siti allosterici sono meno conservate rispetto a quelle dei siti ortosterici. Di conseguenza, questo consente lo sviluppo di modulatori allosterici maggiormente selettivi permettendo di diminuire gli effetti collaterali “off-target”.
-Saturabilità dell’effetto: l’effetto dei modulatori allosterici è dipendente dal ligando ortosterico, per cui una concentrazione crescente di ligando allosterico oltre la saturazione del sito di legame allosterico non aumenta l’entità dell’effetto dell’allosterico ed è limitata dall’azione che ha il ligando ortosterico. In questo modo si evitano effetti collaterali dovuti a un sovradosaggio poiché non sarà mai superabile l’effetto del ligando ortosterico.
-Down regulation recettoriale: i ligandi allosterici, a differenza degli ortosterici, non sono in grado di attivare continuamente il recettore né le vie cellulari che portano a fenomeni di desensibilizzazione o down-regulation recettoriale.
-“Probe” - dipendenza e “signaling” preferenziale: la natura dell’interazione allosterica è unica per ogni combinazione del modulatore allosterico con uno specifico ligando ortosterico (“probe”). Inoltre, la modulazione allosterica può indurre una segnalazione selettiva da parte del ligando ortosterico, che andrà a favorire una particolare via di trasduzione del segnale, attivando determinate molecole effettrici rispetto ad altre.
I modulatori allosterici possono essere classificati sulla base del loro meccanismo di azione. I PAMs (Positive Allosteric Modulators) sono in grado di aumentare l’affinità di legame e/o l’efficacia del segnale dovuto al legame del ligando ortosterico. I NAMs (Negative Allosteric Modulators) sono capaci di diminuire l’affinità di legame e/o l’efficacia del segnale dovuta al legame con l’ortosterico. I NALs (Neutral Allosteric Ligands) sono invece i ligandi che si legano al sito allosterico ma non modulano la funzione recettoriale, ma competono con altri PAMs o NAMs per il sito di legame allosterico. Infine, gli agonisti allosterici (Ago-PAMs) sono ligandi che, nonostante si leghino al sito allosterico, sono in grado di attivare direttamente il recettore anche in assenza di un ligando ortosterico.
Nel laboratorio dove ho svolto la mia tesi è stato sintetizzato il modulatore allosterico positivo del recettore CB2, l’EC21a. Questo composto è stato ottenuto dai ligandi ortosterici CBRs, con struttura piridin-2-onica-3-carbossammidica, semplicemente invertendo la funzionalità ammidica in posizione 3. Il profilo di EC21a è stato caratterizzato mediante saggi di binding e funzionali che hanno portato ai seguenti risultati: l’associazione del radioligando ortosterico [3H]CP55,940 al recettore CB2 è fortemente incrementata in presenza di basse concentrazioni di EC21a. Inoltre, EC21a (a concentrazioni pari a 100 nM) incrementa in maniera significativa la capacità del CP55,940 e di 2-AG, ma non di AEA, di stimolare il legame con il [35S]GTPγS del CB2. Gli stessi saggi funzionali sono stati svolti anche in assenza del ligando ortosterico di riferimento e l’EC21a non ha mostrato alcuna attività, risultato in linea con la sua natura di puro PAM. Studi in vivo hanno messo in evidenza alcune potenzialità terapeutiche di EC21a: in particolare, esso ha mostrato una notevole attività antinocicettiva in un modello murino di dolore neuropatico indotto dall’oxaliplatino e un’azione anticonvulsivante, conferendo resistenza all’attacco epilettico senza causare neurotossicità e deficit motori, su un modello murino di epilessia.
Durante il periodo di tesi mi sono occupata della sintesi di nuovi derivati dell’EC21a, in modo da approfondire le conoscenze riguardo le relazioni struttura-attività (SAR).