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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-09122011-093707


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
GUCCINI, SARA
URN
etd-09122011-093707
Titolo
Linfociti trattati con veleni del fuso: mitotic slippage e induzione di micronuclei in mononucleate euploidi.
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Relatori
relatore Prof. Scarpato, Roberto
Parole chiave
  • mitotic slippage
  • mitotic spindle
  • aneuploidia
  • aneuploidy
  • fuso mitotico
  • human lymphocytes
  • linfociti umani
  • micronuclei
  • micronuclei
  • mitotic slippage
Data inizio appello
29/09/2011
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
29/09/2051
Riassunto
Lo scopo di questo studio è stato quello di analizzare, in un sistema cellulare in
vitro, il significato della presenza di micronuclei in cellule mononucleate indotti in seguito al trattamento con mutageni aneuploidogeni che, interferendo con il corretto funzionamento dell’apparato microtubulare, agiscono causando malsegregazione cromosomica. Ciò ha portato ad approfondire il fenomeno dello slittamento della mitosi: la formazione di un fuso mitotico danneggiato provoca il fallimento della migrazione dei cromosomi ai poli; ciò comporta la formazione di cellule tetraploidi (4N), ovvero cellule che hanno l’aspetto di mononucleate ma che, al loro interno, contengono due nuclei indivisi, poiché i cromosomi, sotto l’azione di tali agenti, si condensano e la cromatina segrega senza la divisione in due nuclei figli. Lo studio è stato condotto su colture di linfociti di sangue periferico trattate con inibitori del fuso mitotico e, come controllo, con agenti clastogeni. Sono state utilizzate tecniche di genetica e citogenetica molecolare: 1) saggio del micronucleo in cellule bloccate alla citodieresi con citocalasina B; 2) analisi in metafase per valutare la presenza di cellule endoreduplicate e con corredo tetraploide; 3) analisi in interfase mediante FISH con l’uso di una sonda locus specifica per identificare lo stato di ploidia delle cellule mononucleate. Poiché un ruolo chiave nel check point del fuso mitotico viene svolto dalla proteina mad2, è stato effettuato anche un saggio in western blotting per valutarne l’ espressione. Solo nelle colture trattate con agenti aneuploidogeni le analisi citogenetiche effettuate hanno confermato la forte induzione di micronuclei nelle cellule mononucleate, la formazione di cellule dal corredo tetraploide o endoreduplicate, e la presenza di mononucleate con micronucleo a corredo sia tetraploide che, aspetto estremamente interessante, diploide. Il saggio in western blot ci ha mostrato una diminuzione della proteina Mad2 nelle colture trattate a prova del mitotic slippage in atto. Al fine di interpretare la presenza di cellule micronucleate 2n, sono state saggiate due ipotesi che tenterebbero di spiegarne l’insorgenza: la prima postula che queste cellule rappresentino una piccola popolazione che si è divisa prima del trattamento con gli agenti aneuploidogeni; per verificarla abbiamo modificato la tempistica del saggio aggiungendo la citocalasina B alla 24esima ora e recuperando alla 44esima . La seconda che siano cellule insensibili alla citocalasina B; per saggiare tali ipotesi sono stati allestiti esperimenti con la latrunculina A, un agente che, a sua volta, sebbene con un diverso meccanismo d’azione, inibisce la polimerizzazione del citoscheletro actinico che determina il fallimento della citodieresi. I nostri risultati hanno dimostrato che la presenza di micronuclei nelle mononucleate non deriva né da cellule che si sono divise prima dell’aggiunta della citocalasina B né da cellule insensibili a tale agente. Si delinea quindi l’ipotesi di un’interferenza tra i meccanismi d’azione degli aneuploidogeni e degli inibitori delle fibre actiniche che si manifesta come una parziale insensibilità a questi ultimi. Di fatto, è probabile che la presenza di veleni del fuso o inneschi un meccanismo di competizione a livello di siti bersaglio, che non sarebbero quindi più completamente accessibili agli inibitori, o determinino, direttamente o indirettamente, la loro inattivazione con conseguente fallimento del blocco della citodieresi in una parte della popolazione cellulare.


ABSTRACT
The aim of present work was to analyse, in an in vitro cellular system, the significance of the presence of micronuclei in mononuclear cells induced
by aneugens that cause chromosomal malsegregation by interfering with the
proper functioning of the microtubule apparatus. This has led to deepening the phenomenon of mitotic slippages: the formation of a damaged spindle causes the failure of the migration of the chromosomes. This involves formation of tetraploid cells (4N), or cells that have the appearance of mononuclear but, within them, contain two undivided nuclei, because chromosomes, under the action of these agents, are condensed and the chromatin segregates without the division into two daughter nuclei .The study was conducted on peripheral blood lymphocyte cultures treated with inhibitors of the mitotic spindle and, as control, with clastogenic agents. Genetic and molecular cytogenetics techniques were used: 1) cytokinesis block micronucleus assay in cells with cytochalasin B, 2) analysis to evaluate the presence of endoreduplicate metaphases and tetraploid cells, 3) analysis of interphase by FISH using a locus specific probe to identify the state of ploidy of mononuclear cells. Since a key role in the checkpoint mitotic spindle is carried by the protein mad2, a western blotting assay was performed to assess its expression. Only in cultures treated with aneugens cytogenetic analysis confirmed the strong induction of micronuclei in mononuclear cells, the formation of tetraploid cells or endoreduplicate metaphases, and the presence of micronucleated mononuclear cells which are both tetraploid and, extremely interesting, diploid. The western blot assay showed us a decrease in protein Mad2 in the aneugen treated cultures, thus indicating progress of the mitotic slippage. In order to understand the presence of micronucleated cells 2n, two hypotheses were tested that attempt to explain the onset: the first postulates that these cells represent a small population that is divided prior to treatment with aneugens; to verify it we changed the timing of the assay by adding cytochalasin B at 24 hours and recovered cells at 44th. The second is that cells are insensitive to cytochalasin B; to test this hypothesis we have set up experiments with latrunculina A, an agent which, albeit with a different mechanism of action, inhibits the polymerization of actin, which determines the failure of cytokinesis. Our results showed that the presence of micronuclei in mononuclear cells is derived from neither cells which are divided before the addition of cytochalasin B nor cells insensitive to this agent. Thus, we think to the possibility of interference between the mechanisms of action of aneugens and inhibitors of actin fibers that manifests as a partial insensitivity to the latter.
In this case, the spindle inhibitors either can compete at level of target site with the actin inhibitors, or can directly inactivate the actin inhibitors causing subsequent failure of cytokinesis block in a part of that dividing cell population.
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