• molecular dynamics
• covalent docking
• antioxidant
• oxidative stress
• dinamica molecolare
• docking covalente
• antiossidante
• stress ossidativo
• Nrf2
• Keap1

Lo stress ossidativo è una condizione fisiopatologica causata da uno squilibrio tra la produzione di specie chimiche ossidanti e i meccanismi di difesa cellulare portando alla sovraproduzione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) di cui alcuni esempi sono l’anione superossido (O2ˉ·), il radicale ossidrilico (OH·) e il perossido di idrogeno (H2O2).
La sede più importante per la produzione delle specie reattive dell’ossigeno è rappresentata dai mitocondri nei quali è presente la catena di trasporto degli elettroni in cui l’ossigeno molecolare è l’accettore finale di elettroni e questo è un processo fondamentale per la respirazione cellulare aerobica negli organismi eucariotici.
La produzione delle specie reattive dell’ossigeno altera il normale meccanismo di difesa antiossidante dell’organismo per cui esso per contrastare il danno a proteine, lipidi e acidi nucleici ha messo in atto dei meccanismi di difesa tra i quali è risultata importante l’attivazione del percorso KEAP-1/NRF-2.
KEAP-1 controlla le concentrazioni citoplasmatiche di NRF-2 mantenendole basse grazie alla degradazione mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma, ma sotto stress ossidativo o in presenza di attivatori di NRF-2, l’interazione tra KEAP-1 e NRF-2 viene interrotta e si ha la mancata degradazione ubiquitina-dipendente di NRF-2.
In conseguenza di ciò NRF-2 può legarsi alla sequenza ARE causando la trascrizione dei geni citoprotettivi che combattono lo stress ossidativo.
Altra peculiarità di KEAP-1 è la presenza di numerose cisteine reattive presenti nei suoi domini; queste sono capaci di formare legami covalenti con vari composti permettendo una più facile traslocazione nucleare di NRF-2 e l’attivazione di geni cito protettivi. La cisteina più rilevante e quindi oggetto di studio è stata la Cisteina 151 (Cys 151).
Utilizzando metodiche computazionali obiettivo della ricerca è stato selezionare composti che abbiano un’affinità per il sito di legame (KEAP-1) valutando composti naturali e farmaci prima attraverso il docking molecolare e successivamente mediante la dinamica molecolare. In una seconda fase, invece, sono stati valutati composti in grado di formare un legame covalente con la Cisteina 151 (Cys 151) di KEAP-1. La ricerca dei composti naturali, valutati attraverso le proprietà chimico-fisiche e ADMET, ha portato alla selezione dei 3 composti migliori: Meranzin idrato (ZINC000000338310), Isoxanthochimolo (ZINC000059204232) e Gingerenone A (ZINC000001531844), che pur presentando nuclei chimici diversi hanno dimostrato di instaurare interazioni interessanti ed esaustive ai fini della ricerca tanto in fase di screening virtuale quanto in quella di dinamica molecolare nella quale hanno mostrato una buona stabilità per tutto il tempo della simulazione.
La ricerca dei farmaci ha portato alla selezione di Nedocromil (ZINC000003782807), Zopolrestat (ZINC000000538557) e Acido bempedoico (ZINC000003948738) che sono rispettivamente uno stabilizzante i mastociti, un inibitore dell’aldoso reduttasi e un ipolipidemizzante; le loro interazioni hanno però dimostrato una buona affinità per il sito in esame e compatibilmente con un buon profilo di tossicità valutando LD50 di ognuno di essi possono essere considerati possibili composti antiossidanti attivi sul percorso KEAP-1/NRF-2.
Infine avvalendosi del docking covalente sono stati investigati composti di sintesi capaci di legare il gruppo solfidrilico della Cisteina 151 (Cys 151) mediante il meccanismo della reazione di Michael.
Sono state prese in considerazione le molecole che presentano i seguenti gruppi funzionali: nitrili, epossidi, triplo legame, doppio legame, nucleofili, arili, acido boronico e il nucleo beta lattamico e i risultati hanno portato alla selezione dei seguenti composti: Z44395343, Z1147519622, Z1645631225, Z4900127283, Z4097795078, Z1562139945, Z4386044737 e Z2766916017.


Oxidative stress is a pathophysiological condition caused by an imbalance between the production of oxidizing chemical species and cellular defense mechanisms leading to the overproduction of reactive oxygen species (ROS) of which some examples are superoxide anion (O2ˉ·), hydroxyl radical (OH·) and hydrogen peroxide (H2O2).
The most important site for the production of reactive oxygen species is represented by the mitochondria in which the electron transport chain is present in which molecular oxygen is the final electron acceptor and this is a fundamental process for cellular respiration aerobics in eukaryotic organisms.

The production of reactive oxygen species alters the body's normal antioxidant defense mechanism, therefore, to counteract damage to proteins, lipids and nucleic acids, it has implemented defense mechanisms among which the activation of the KEAP-1/NRF-2 pathway.
KEAP-1 controls the cytoplasmic concentrations of NRF-2 by keeping them low thanks to degradation mediated by the ubiquitin-proteasome system, but under oxidative stress or in the presence of NRF-2 activators, the interaction between KEAP-1 and NRF-2 is disrupted and there is a lack of ubiquitin-dependent degradation of NRF-2.
As a consequence, NRF-2 can bind to the ARE sequence causing the transcription of cytoprotective genes that fights against oxidative stress.
Another peculiarity of KEAP-1 is the presence of numerous reactive cysteines present in its domains; these are capable of forming covalent bonds with various compounds allowing easier nuclear translocation of NRF-2 and the activation of cytoprotective genes. The most relevant cysteine ​​and therefore the object of study was Cysteine ​​151 (Cys 151).
Using computational methods, the aim of the research was to select compounds that have an affinity for the binding site (KEAP-1), evaluating natural compounds and drugs first through molecular docking and subsequently through molecular dynamics. In a second phase, however, compounds capable of forming a covalent bond with Cysteine ​​151 (Cys 151) of KEAP-1 were evaluated. The search for natural compounds, evaluated through chemical-physical properties and ADMET, led to the selection of the 3 best compounds: Meranzin hydrate (ZINC000000338310), Isoxanthochimol (ZINC000059204232) and Gingerenone A (ZINC000001531844), which, despite presenting different chemical properties, have to establish interesting and exhaustive interactions for research purposes both in the virtual screening phase and in that of molecular dynamics in which they showed good stability throughout the simulation time.
The search for drugs led to the selection of Nedocromil (ZINC000003782807), Zopolrestat (ZINC000000538557) and Bempedoic acid (ZINC000003948738) which are respectively a mast cell stabilizer, an aldose reductase inhibitor and a lipid-lowering agent; However, their interactions have demonstrated a good affinity for the site under examination and compatibly with a good toxicity profile by evaluating the LD50 of each of them they can be considered possible antioxidant compounds active on the KEAP-1/NRF-2 pathway.
Finally, using covalent docking, synthetic compounds capable of binding the sulfhydryl group of Cysteine ​​151 (Cys151) through the Michael reaction mechanism were investigated.
Molecules presenting the following functional groups were taken into consideration: nitriles, epoxides, triple bonds, double bonds, nucleophiles, aryls, boronic acid and the beta lactam nucleus and the results led to the selection of the following compounds: Z44395343, Z1147519622, Z1645631225 , Z4900127283, Z4097795078, Z1562139945, Z4386044737 and Z2766916017.