• invecchiamento

RIASSUNTO
Introduzione: Il danno ischemico renale rappresenta la causa d’insufficienza renale acuta sia nel rene nativo che in quello trapiantato: l’aumento di radicali liberi dell’ossigeno porta all’apoptosi o alla morte cellulare. Numerosi studi hanno evidenziato che il resveratrolo (RSV), un polifenolo presente nel vino rosso, è efficace nella protezione del danno da ischemia-riperfusione (IR) grazie sia all’attività antiossidante sia all’attivazione di segnali molecolari, tra cui l’ ossido nitrico (NO). Oltre a ciò è stato più recentemente dimostrato che il RSV è in grado di modulare l’espressione e l’attività di SIRT-1, una proteina che appartiene ad una famiglia di istone deacetilasi (HDAC), le sirtuine.
Queste proteine sono capaci di determinare condensamento cromatinico e silenziamento genico e, pertanto, sono note per il loro ruolo antiaging. Le sirtuine, inoltre, modulano l’attività di proteine non istoniche coinvolte nei processi di sopravvivenza cellulare ed aventi un ruolo anti-infiammatorio ed antiapoptotico, per cui è ragionevole ipotizzare che abbiano un ruolo protettivo anche nel dal danno da ischemia e riperfusione a livello dei principali organi (tra cui il rene) .
Scopo della ricerca: Recenti studi sperimentali evidenziano come alcuni composti fenolici naturali presenti nel vino, siano in grado di proteggere dal danno da ischemia e riperfusione ed inoltre siano capaci di modulare l’espressione di SIRT-1.
Lo scopo di questa tesi sperimentale è stato verificare se la malvidina, la quercetina, il tirosolo, l’acido ferulico e la catechina, composti naturali presenti a concentrazione significativa nel vino, abbiano un’azione di protezione nel danno indotto da riperfusione ed, inoltre, verificare se siano in grado di modulare l’espressione di SIRT-1, ERK e HIF 2α.
Materiali e metodi: Sono state utilizzate cellule di tubulo prossimale umano provenienti da una linea immortalizzata. La sperimentazione è stata suddivisa in due fasi sperimentali:
Fase 1.
Allestimento di un modello cellulare di danno ossidativo: sono state utilizzate concentrazioni diverse di H2O2 e tempi di incubazione diversi (2h, 5h e 18h); la mortalità cellulare è stata determinata dopo 24h tramite il TRYPAN BLEU. Inoltre una volta selezionati concentrazione e tempo di incubazione, sono stati valutati i tempi di attivazione di ERK e Akt .
Fase 2.
Valutazione dell’espressione di SIRT-1 da parte di vini poveri di RSV: le cellule sono state divise in 5 sottogruppi sperimentali: un controllo con cellule incubate in presenza del solo mezzo di coltura; RSV con cellule incubate in presenza di resveratrolo 200nM; cellule incubate con 3 diversi vini provenienti da 3 vitigni diversi (V1,V2 e V3), caratterizzati da un non significativo contenuto in RSV e diluiti 1:1000. Dopo 24h di incubazione, le cellule sono state lisate per l’analisi Western Blot.
Valutazione delle attività biologiche di fenoli naturali presenti nel vino:
sono stati allestiti 7 gruppi sperimentali: 1) Controllo; 2) resveratrolo; 3) malvidina; 4) tirosolo; 5) quercetina; 6) acido ferulico; 7) catechina. Le cellule sono state incubate per 24h in presenza delle varie sostanze (tutte 200nM), quindi lisate per l’analisi Western Blot di SIRT-1, ERK ed HIF-2α.
Protezione dal danno ossidativo: sono stati allestiti 9 gruppi sperimentali: 1) Controllo; 2) vino V1 diluito 1:1000; 3) resveratrolo 200nM; 4) malvidina 200nM; 5) tirosolo 200nM; 6) quercetina 200nM; 7) acido ferulico 200nM; 8) catechina 200nM ; 9) controllo H2O2.
Dopo 24 ore di incubazione con le sostanze, tutti i gruppi, ad eccezione del controllo, sono stati incubati per 2h con H2O2 0.3 mM.
La protezione da danno citotossico è stata valutata dopo 18h dalla fine dell’insulto tramite il TRYPAN BLEU e con un test a fluorescenza che usa il bis-AAF-R110 (bis-alanil,alanil, fenilanalil rodamina110).
Risultati:
Dalle prime due fasi sperimentali è stato possibile verificare che l’incubazione di 2h delle cellule tubulari con con H2O2 0.3M determina un danno citotossico; inoltre l’analisi dei segnali molecolari identifica il danno cellulare indotto come un danno ossidativo da riperfusione.
La valutazione dell’espressione di SIRT-1 dopo incubazione con vini/RSV evidenzia un incremento da due a tre volte dell’espressione di SIRT-1 per i 3 vini analizzati rispetto al controllo, analogamente per quanto osservato per il gruppo RSV.
Inoltre l’analisi western blot evidenzia che tutti i composti fenolici analizzati determinano un aumento significativo dell’espressione di SIRT-1, seppure la modulazione di ERK e di HIF-2α per alcuni composti risulta variabile.
In particolare ERK risulta attivato in maniera significativa dal resveratrolo, dalla malvidina, dal tirosolo e dalla catechina mentre HIF-2α è aumentato significativamente col resveratrolo, con la malvidina, con la quercetina e col tirosolo.
La valutazione della protezione dal danno ossidativo effettuata con entrambi i test di citotossicità sopra citati, mostra che il vino rosso V1 ed i singoli composti fenolici analizzati (RSV, malvidina, tirosolo, quercetina, acido ferulico e catechina) sono in grado di proteggere in maniera significativa dal danno ossidativo da riperfusione.
Conclusioni:
Questo studio ha evidenziato che nel vino ci sono altri composti oltre al RSV che sono capaci di modulare SIRT-1.
I composti fenolici analizzati proteggono dal danno ossidativo tipico della fase di riperfusione. Sulla base dei dati emersi dall’analisi di alcuni segnali (SIRT-1, ERK ed HIF 2α) è inoltre possibile affermare che l’attività biologica di queste sostanze va ben oltre il semplice effetto scavenger ampliamente documentato.