• ottimizzazione dell'analisi quantitativa
• ottimizzazione dell'analisi qualitativa
• esposizione al cadmio
• Arabidopsis thaliana
• peptidi tiolici

L’enzima fitochelatina sintasi (PCS) è una gamma-glutamil-cisteina dipeptidil (trans)peptidasi appartenente al “Clan CA” delle cisteina proteasi “papain like”. La PCS è espressa costitutivamente nella grande maggioranza delle piante, in altri organismi eucariotici e in alcuni cianobatteri. Nel clade delle Plantae, particolarmente nelle streptofite, laddove sia stata funzionalmente caratterizzata, la PCS mostra una palese attività transpeptidasica, catalizzando la sintesi delle fitochelatine, peptidi tiolici del tipo (gamma-glutamil-cisteinil)n-glicina (n=2-5).
L’attività transpeptidasica è attivata dalla presenza di alcuni metalli pesanti (elementi caratterizzati dal possedere un peso specifico superiore a 5 g cm-3), quali cadmio (Cd), mercurio (Hg), piombo (Pb), o dal metalloide arsenico (As). Grazie ai gruppi tiolici dei residui di cisteina che le compongono, le fitochelatine sono in grado di chelare gli ioni dei suddetti metall(oid)i, formando con essi complessi che vengono prontamente compartimentati nel vacuolo, liberando così il citoplasma da tali elementi in forma libera e riducendone i potenziali effetti tossici.
Ciò premesso, oltre che nella disintossicazione di metal(loid)i tossici, di recente è stata ipotizzata una possibile funzione primigenia delle fitochelatine nella regolazione omeostatica dei fabbisogni fisiologici di micronutrienti metallici, quali ferro(II)/(III), rame, zinco, ecc., che – al di sotto della loro soglia di tossicità – svolgono funzioni indispensabili per la cellula vegetale.
Per verificare o confutare tale ipotesi è necessario utilizzare metodi di analisi molto sensibili ed affidabili, in grado di rilevare efficacemente concentrazioni di fitochelatine anche molto esigue, che potrebbero essere prodotte a seguito di esposizione a livelli fisiologici di micronutrienti metallici.
A tal fine, in una prima fase del lavoro svolto in questa tesi, sono state allestite colture in vitro di Arabidopsis thaliana, un’angiosperma-modello ben conosciuta e studiata in biologia vegetale. Gli individui da campionare sono stati cresciuti sterilmente in terreno liquido addizionato con una soluzione di solfato di cadmio (CdSO4) in grado di attivare la PCS ed indurla a produrre fitochelatine.
Gli estratti ottenuti sono stati poi analizzati per mezzo di un sistema di cromatografia ad alta performance (HPLC), con due diverse tecniche di derivatizzazione (post-colonna la prima e pre-colonna la seconda), e per mezzo di un sistema evoluto di spettrometria di massa (HPLC-ESI-MS-MS). In seguito ad uno studio comparativo effettuato tra i tre sistemi di cui sopra, l’HPLC-ESI-MS-MS ha mostrato di possedere un’elevata sensibilità, affidabilità e specificità verso i peptidi tiolici oggetto d’esame. Tale tecnica, dunque, si è rivelata la migliore candidata per essere impiegata in indagini volte alla quali/quantificazione di fitochelatine prodotte non solo a seguito di esposizione al cadmio, ma anche a micronutrienti metallici presenti intracellularmente in concentrazioni fisiologiche.