• carbossimetilchitosano
• immunoterapia
• ovalbumina
• Pluronic® F-127
• termogel

Nel microambiente tumorale, cellule cancerose e componenti cellulari non trasformate come fibroblasti, cellule endoteliali e immunitarie, comunicano tra di loro grazie al rilascio di fattori di crescita e citochine ma anche grazie alla comunicazione mediata da vescicole. Attraverso quest’ultime, i fibroblasti associati al cancro, i moniciti e i macrofagi sono in grado di trasferire proteine, come il complesso pMHC-I (MHC1 legante un peptide processato dal sistema immunitario), alle cellule tumorali rendendole bersaglio dei linfociti CD8+ e inducendo una riduzione della massa tumorale.
In un precedente lavoro è stata studiata la possibilità di sfruttare questo processo del sistema immunitario, basato sulla capacità delle cellule che presentano l’antigene (APC) di trasferire il complesso pMHC-I alle cellule tumorali. Il trattamento consiste nell’iniettare nella massa tumorale monociti attivati caricati con l’antigene Ovalbumina (OVA), in modo da permettere il trasferimento del complesso pMHC-I alle cellule tumorali ed indurre la risposta citotossica dei linfociti CD8+. Il problema principale riscontrato consiste nel rapido allontanamento dell’antigene dal sito di iniezione che porta ad una riduzione dell’efficacia del trattamento.
Come proseguo del lavoro è stato quindi pensato di aumentare la disponibilità e la permanenza nel sito di iniezione del peptide OVA, senza il quale i monociti e i macrofagi non possono rendere le cellule cancerose target dell’azione dei linfociti CD8+.
Lo scopo del presente lavoro di tesi è quello di aumentare la presenza nel tempo del peptide OVA nell’ambiente tumorale, sviluppando un termogel iniettabile gelificante in situ. Questo è stato ottenuto sfruttando il polimero termosensibile Pluronic® F-127 ed il polimero bioerodibile, Carbossimetilchitosano (CMCS).
Sono stati studiate diverse formulazioni e la migliore è risultata essere costituita dal 14% (w/v) di Pluronic® F-127 e 3% (w/v) di CMCS in 0.4% NaCl. La transizione sol-gel è stata dapprima studiata mediante Tilt Test a 37°C e poi la formulazione è stata caratterizzata dal punto di vista reologico eseguendo scansioni in temperatura, per individuare l’esatta temperatura di transizione sol-gel e verificare la reversibilità della gelificazione. È stato inoltre eseguito il Time Sweep Test per verificare il tempo di gelificazione. I risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli di una formulazione costituita solo da Pluronic® F-127 (20% in 0.4% NaCl).
Parallelamente l’antigene è stato caricato in nanoparticelle e in liposomi, in modo da fornire un’ulteriore protezione dell’antigene dalla degradazione e favorire l’internalizzazione tramite meccanismi biologici quali fagocitosi e transcitosi.
Le nanoparticelle (NP) di Carragenina (CG) e Chitosano Quaternarizzato (QUAL) sono state preparate per self- assembly aggiungendo a 2 mL di CG 0.57 mg/mL, 0.4 mL di QUAL 1 mg/mL. Per ottenere le nanoparticelle caricate con OVA, 240 μl di soluzioni di OVA a varie concentrazioni sono stati aggiunti nella soluzione di CG o di QUAL prima del self-assembly .
I liposomi caricati con OVA 0.1 mg/mL sono stati preparati tramite reidratazione del film lipidico composto da HSPC:DMG-PEG:Chol (3:1:1 w/w). I liposomi e le NP sono stati analizzati tramite light scattering, ottenendo diametro medio di 105.3 ± 0.665 nm, PDI 0.071 ± 0.017 per i liposomi e dimensioni comprese tra 180 e 360 nm per le NP. La percentuale di OVA incapsulata nei liposomi e nelle NP è stata quantificata tramite saggio dell’acido bicinconinico (BCA) ed è risultata pari al 30% per i liposomi e inferiore al 12 % per le NP. Le dimensioni ottimali dei liposomi unite alla più alta efficienza di incapsulamento hanno portato alla scelta di aggiungere i liposomi nel termogel.
Sono stati condotti test di erosione e rilascio del peptide OVA dal gel A (14% w/v di Pluronic® F-127 e 3% w/v di CMCS) e B (Pluronic® F-127 20% in 0.4% NaCl). 10 μl di una soluzione di OVA (10 mg/ml) sono stati aggiunti a 1 mL di ciascun gel ed è stato valutato il rilascio di OVA quantificando il peptide mediante il test dell’acido bicinconinico (BCA). Sono in corso studi di rilascio di OVA dal gel caricato con OVA libera e caricata in liposomi.
Le valutazioni biologiche sono state condotte sulla linea cellulare Balb/3T3 clone A31. La citotossicità è stata valutata mediante il saggio WST-1 dopo 4 ore e dopo 24 ore di contatto dei gel A e B con le cellule. Ulteriori indagini di citotossicità sono in corso. Inoltre, sono stati condotti studi preliminari di tossicità in vivo su topi BALB/c, mentre sono ancora in corso test di efficacia.