• danno ossidativo
• età gestazionale
• H2AX
• linfociti
• neonati

Negli ultimi anni sempre maggior interesse è stato riservato, a fronte della forte evidenza epidemiologica che collega il ritardo di crescita intrauterina con malattie metaboliche in età adulta, allo studio di bambini nati piccoli per età gestazionale SGA (Small for Gestational Age) e di bambini LGA (Large for Gestational Age) rispetto ai nati di peso adeguato AGA (Adequate for Gestational Age). I meccanismi alla base di questa associazione sono in gran parte sconosciuti ma l’esposizione a un ambiente uterino avverso induce a una riprogrammazione fetale con cambiamenti permanenti nei pathwaγ endocrini e metabolici, aumentando così il rischio di sviluppare in età adulta iposomia, malattie cardiovascolari e metaboliche quali ipertensione arteriosa, obesità, dislipidemie, insulino-resistenza, ridotta tolleranza glucidica, diabete di tipo II e disturbi dell’attenzione con rilevanti implicazioni sulla salute pubblica. Questo lavoro mira ad indagare specifici profili cellulari e molecolari in gruppi di bambini SGA LGA e AGA dei quali verrà valutato lo stato di integrità nucleare e cellulare utilizzando biomarcatori precoci di stress ossidativo (livelli di ossidazione della membrana cellulare) e di danno al DNA (fosforilazione dell’istone H2AX). È allestito uno studio su un campione di neonati a termine (< 34 settimane) e pretermine (≥ 34 settimane) classificati in base all’età gestazionale in SGA LGA AGA in cui sono valutate le differenze nell’espressione dei suddetti marcatori alla nascita e due mesi dopo la nascita. Tutti i soggetti sono reclutati presso l’unità di Neonatologia dell’Ospedale Universitario di Pisa. I prelievi di sangue sono effettuati dal cordone ombelicale al momento della nascita e dal sangue periferico al secondo prelievo. Gli eventi della fosforilazione dell’istone H2AX sulla Ser139 in risposta alla formazione di rotture a doppio filamento al DNA (DSB), permettono di valutare l’integrità del genoma. Questo meccanismo porta alla formazione di foci nucleari chiamati γ-H2AX che sono facilmente quantificabili in una popolazione cellulare. Lo stress ossidativo, che è legato a uno stato di infiammazione cronica, può predisporre a instabilità genomica attraverso la formazione di DSB. La determinazione del marcatore di danno al DNA (γ-H2AX) è effettuata in fluorescenza mediante osservazione microscopica. Il campione di sangue prelevato da ciascun soggetto è trattato come segue: vengono allestite colture cellulari (replicati) in terreno completo immediatamente processate secondo le procedure standard di recupero e fissazione per ottenere preparati di linfociti T non stimolati. Su questi viene eseguita la ricerca in immunofluorescenza dei foci γ-H2AX usando un anticorpo primario specifico, visualizzabile con anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo. Per ogni soggetto la presenza di foci γ-H2AX viene valutata calcolando la percentuale media ottenuta in due replicati allestiti di nuclei contenenti spot fluorescenti sulla popolazione analizzata in 1000 cellule per coltura. Tale analisi prevede inoltre il calcolo del numero medio di foci per nucleo e la frequenza media di foci per cellula H2AX positiva. Il danno cellulare mediato da stress ossidativo viene valutato mediante analisi dello stato di ossidazione della membrana cellulare. In questo caso un piccolo volume di sangue viene messo in coltura a 37°C per 47,30 h in presenza di fitoemoagglutinina per stimolare i linfociti T alla divisione. Viene poi aggiunta la sonda ipidica fluorescente BODIPΓ, in grado di inserirsi nella membrana cellulare che, in condizioni fisiologiche (membrane plasmatiche non ossidate) conferisce una fluorescenza rossastra al citoplasma delle cellule recuperate e fissate, mentre membrane ossidate presenteranno uno shift della fluorescenza citoplasmatica verso il verde. La valutazione dello stato di ossidazione delle membrane e quindi il danno cellulare dei linfociti periferici verrà valutato in percentuale come valore medio del numero di cellule con fluorescenza verde citoplasmatica su un totale di 1000 cellule analizzate per replicato. La popolazione di neonati in studio consta di 46 soggetti suddivisi in 23 e 23 neonati campionati, rispettivamente, alla nascita e circa 2 mesi dopo la nascita. I dati preliminari fin qui analizzati, espressi a livello di ciascun gruppo come media ± l’errore standard della media, indicherebbero un significativo aumento del danno ossidativo e genomico negli individui LGA rispetto ai neonati AGA o SGA. Al tempo stesso si rileverebbe un incremento, sebbene non significativo, dello stato di ossidazione delle membrane cellulari quando i neonati abbandonano l’ambiente intrauterino. Un’altra interessante indicazione emersa sta nel fatto che i marcatori di danno cellulare e nucleare sembrano correlare (positivamente o negativamente) con i parametri quantitativi come peso, lunghezza, circonferenza cranica o z-score che i neonatologi utilizzano, insieme alla durata della gravidanza, per classificare i neonati dal punto di vista gestazionale.