• astrocytes
• autism
• epilepsy
• neuron
• potassium channels

Analytical Summary
Title of PhD Thesis: Molecular characterization in autism-epilepsy endophenotype
PhD STUDENT: Marchese Maria
The identification of the pathological underpinnings of complex neurodevelopmental disorders such as autism spectrum disorders (ASD) and epilepsy is becoming more complex due to the evolving diagnostic criteria and the ever expanding genetic landscape. However, information derived by study of genomic copy number variations (CNVs) and single gene disorders in both ASD and epilepsies has proposed attention to biologic processes related to brain development and neuronal activities. Defects in potassium spatial buffering in the brain determined by alterations in different K+ channels have been associated with both autism and epilepsy, and their endophenotype (AEP). The high degree of clinical and physiological overlap has also led to propose the terms of channelASD and channelepsy as conditions sharing similar pathomechanisms. Sicca and co-workers have recently demonstrated that alterations in Kir channels can be involved in the comorbid condition of ASD and epilepsy, and have defined some of the biological basis of the clinically relevant AEP endophenotype. Our work hypothesis was to disentangle the complexity of AEP endophenotype looking at the dysregulated tripartite synapse. To test our hypothesis, we initially tested the relative frequency of variants in genes encoding Kir channels, and described an even stronger genetic association between changes in KCNJ10 and autism/epilepsy with intellectual disability. Our results suggested that the molecular mechanism contributing to disease status likely related to an increase in either surface expression or conductance of Kir4.1 channels, or both.
At the same time we studied in vitro a new genetic variant in KCNJ2, the gene coding for Kir2.1 channels. Both electrophysiological investigations and biochemical analyses in human and murine astrocytes demonstrated that Kir2.1 in AEP works stabilizing the plasma membrane, and influencing protein degradation. Therefore, a more detailed investigation of the physiological and pathological role of Kir channels is emerging and require a further assessment using tools in vivo. By adopting the easy-to-handle zebrafish model, we observed that kcnj10a morphant could not be complemented by the R18Q variant, a relatively frequent mutation in KCNJ10 associated with AEP.
Neurons are not the single contributor to defective brain mechanisms in ASD and epilepsy. Similarly, astrocytes might represent a crucial target for the pharmacological control of abnormal electrical discharge and synaptic function, at least in certain clinical conditions. Although we did not find clear pathogenic links between genetic variants in the astrocytic GLIALCAM gene and AEP-macrocephaly comorbidity, we might have miss small effect size because of a limited study; however, we corroborated the notion that variants in PTEN might contribute to AEP. We then decided to overcome the difficulties and labor-intensive single gene studies and defined a set of potential genes collaborating and coregulated with Kir channels in silico and analyzed their coding regions adopting massive parallel sequencing. We detected a group of rare variants segregating with the comorbid AEP and macrocephaly endophenotype located in proteins involved in glutamate transport and metabolism as well as in potassium conductance. However, further work will be required to functionally relate these variants with dysfunctional astrocyte metabolism and to analyze the larger number of common predictably deleterious changes observed in our study. One interesting finding was identification of a new variant in STXBP1, and the generation of a stable knock-out strain in zebrafish. Initial analyses in the homozygous stxbp1as3000 strain suggest that STXBP1 contributes to disruption of development plan in zebrafish and to larval behavior, whereas heterozygous loss of gene function impairs larval movement under stress conditions. The mechanicistic results obtained in our study will offer solid ground to more complete behavioural phenotyping in mouse models and would permit high-throughput screening for molecules and drugs able to offer new therapeutic perspectives in ASD and epilepsy.

Riassunto Analitico
Titolo tesi: Molecular characterization in autism-epilepsy endophenotype
Dottorando: Marchese Maria
Identificare la relazione di disturbi complessi come i disturbi dello spettro autistico (ASD) e l'epilessia sta diventando sempre più complesso a causa dei mutati criteri diagnostici e delle numerose informazioni che la genetica offre. Tuttavia, le informazioni derivate dallo studio dei riarrangiamenti genomici e del numero di copie di varianti (CNV) e quelle derivate da malattie monogeniche che si presentano con ASD oppure epilessia ha posto sempre più attenzione ai processi biologici che riguardano lo sviluppo del cervello. I difetti nella distribuzione spaziale del potassio nel cervello sono determinati da alterazioni in diversi canali del K+, associati sia all' autismo che all'epilessia. L'elevato grado di sovrapposizione clinica e fisiologica ha condotto ad una nuova terminologia (channelASD e channelepsy) per identificare condizioni che condividono meccanismi patogenetici simili. Ricercatori dell'IRCCS Stella Maris hanno recentemente dimostrato che alterazioni dei canali del potassio Kir possono essere coinvolti nella comorbidità dell'ASD e dell'epilessia, definendo alcune delle basi biologiche clinicamente rilevanti nell' endofenotipo autismo-epilessia (AEP). La nostra ipotesi di lavoro è stata quella di distinguere la complessità dell'endofenotipo AEP basandoci sullo studio dei meccanismi molecolari che coinvolgono la sinapsi tripartita. Per testare la nostra ipotesi, in primo luogo abbiamo analizzato la frequenza relativa di varianti nei geni che codificano per i canali Kir, ed abbiamo riportato una significativa associazione tra il gene KCNJ10 e autismo/epilessia con disabilità intellettiva. I nostri risultati suggeriscono che il meccanismo molecolare che contribuisce alla malattia potrebbe essere dovuto ad un provvisorio aumento sia dell'espressione di superfice che della conduttanza del canale Kir4.1, o di entrambi i meccanismi.
Allo stesso tempo, abbiamo studiato in vitro una nuova variante genetica in KCNJ2, il gene codificante il canale Kir2.1. Indagini elettrofisiologiche e analisi biochimiche in astrociti hanno dimostrato che il canale Kir2.1 nell'AEP determina una maggiore stabilizzazione della membrana plasmatica, e influenza la degradazione delle proteine. Indagini più dettagliate sul ruolo fisiologico e patologico dei canali Kir hanno poi utilizzato il loro ruolo in vivo. Mediante l'adozione di modelli animali facili da manipolare (zebrafish) abbiamo offerto osservazioni preliminari in morfanti kcnj10a che dimostrano come la mutazione R18Q nel gene KCNJ10 umano (una causa relativamente frequente di AEP) non sia in grado di complementare il fenotipo animale ove la funzione del gene di zebrafish è temporaneamente spenta.
Gli astrociti allo stesso modo dei neuroni, potrebbero rappresentare un obiettivo fondamentale per il controllo farmacologico della scarica elettrica anomala e funzione sinaptica, almeno in certe condizioni cliniche neuropsichiatriche come l'AEP. Infatti, gli stessi effetti osservati su modelli cellulari eterologhi di canali Kir mutati sono stati osservati in vitro in astrociti umani e murini. Anche se nel nostro studio non abbiamo trovato un chiaro collegamento patogenetico tra varianti nel gene GLIALCAM e l'endofenotipo AEP con macrocefalia, la casistica relativamente piccola potrebbe averci fatto sfuggire un effetto minimo. D'altra parte, abbiamo corroborato il ruolo di varianti in PTEN nello stesso endofenotipo. Per avere una visione più ampia sui determinanati molecolari di AEP oltre il test del singolo gene, abbiamo definito una serie di potenziali geni che collaborano con i canali Kir in silico e adottato metodi di sequenziamento massivo parallelo per poter rilevare e prioritizzare le varianti geniche prioritarie. Abbiamo scoperto che un gruppo di varianti rare, segreganti con la comorbidità del fenotipo AEP con macrocefalia appartengono alle proteine coinvolte nel trasporto e nel metabolismo del glutammato e nella conduttanza del potassio. Gli studi futuri dovranno dare valore funzionale a queste varianti così come al significato delle tantissime alterazioni genetiche osservate come comuni nella poplazione ma potenzialmente deleterie per la funzione astrocitaria. Un risultato interessante è stato anche l'identificazione di una nuova variante in STXBP1, e la generazione di un modello knock-out stabile in zebrafish. Dalle prime analisi della linea omozigote stxbp1as3000 possiamo ipotizzare che STXBP1 contribuisce alla rottura del piano di sviluppo in zebrafish e al comportamento larvale, mentre la perdita del gene in eterozigosi ostacola il movimento in condizioni di stress. I risultati ottenuti offriranno un terreno solido per una più completa fenotipizzazione comportamentale in un futuro modello murino, e potrebbero favorire un più rapido screening su larga scala di molecole e farmaci capaci di influenzare il modello animale e per sviluppare nuove prospettive terapeutiche in ASD e epilessia.