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Thesis etd-09082008-230018


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
BARDINI, FRANCESCO
URN
etd-09082008-230018
Thesis title
Analisi del ruolo dello splicing alternativo del gene BARD1 nella carcinogenesi mammaria umana
Department
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Course of study
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Supervisors
Relatore Lombardi, Grazia
Relatore Caligo, Maria Adelaide
Keywords
  • bard1
  • carcinoma mammario
  • splicing alternativo
Graduation session start date
25/09/2008
Availability
Withheld
Release date
25/09/2048
Summary
Diverse evidenze sperimentali indicano che BARD1 (BRCA1 associated RING domain 1) sia un gene soppressore tumorale. BARD1 è stato infatti identificato come il principale partner del gene di suscettibilità al carcinoma della mammella e/o ovaio BRCA1 in vivo agendo da regolatore della sua stabilità, localizzazione e attività nel mantenimento della stabilità genomica, nel riparo del danno al DNA e nella regolazione della trascrizione. E’ stata inoltre dimostrata una funzione di BARD1 indipendente da BRCA1, nell’induzione dell’apoptosi in modo dipendente da P53 in risposta a stress genotossici. Mutazioni somatiche nel gene BARD1 sono state descritte in pazienti con tumore alla mammella o all’ovaio e mutazioni germinali sono state identificate in pazienti con familiarità per il cancro alla mammella, negativi all’analisi mutazionale per BRCA1 e BRCA2, geni di suscettibilità a tale neoplasia.
Nel laboratorio dove sto svolgendo la tesi sono state recentemente identificate per il gene BARD1 almeno otto varianti di splicing, di cui sette mai descritte prima, in linfociti umani e tessuti peritumorali e tumorali di mammella. Tutte presentano una delezione di uno o più esoni, codificanti domini funzionali importanti sia per la localizzazione di BARD1 che per l’interazione con BRCA1. Due di queste varianti (RIN e delta), mancanti del dominio di interazione con BRCA1 e del segnale di esporto nucleare, mantengono il corretto codice di lettura, mentre nelle rimanenti l’evento di splicing determina la formazione di un codone di stop prematuro. Lo splicing alternativo potrebbe essere un meccanismo per generare isoforme di BARD1 con nuove funzioni, e rappresentare una potenziale strategia di inibizione della funzione di BARD1 nei tumori.
Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato dunque di valutare il ruolo delle varianti di splicing di BARD1 nella carcinogenesi mammaria umana.
Uno studio preliminare su una selezione di tessuti tumorali e peritumorali di mammella, utilizzando due anticorpi diretti rispettivamente verso la regione N-terminale (N19) e C-terminale (C20) della proteina., ha evidenziato che BARD1 sembrerebbe maggiormente espresso nelle cellule tumorali e delocalizzato nel citoplasma rispetto ad una debole e prevalente espressione nucleare nelle cellule normali. In particolare il 10% circa dei casi di tumore mostra una diffusa positività citoplasmatica con l’anticorpo per l’estremità C-terminale, mentre risulta negativo per l’espressione di BARD1 con l’anticorpo per l’estremità N-terminale.
Questi risultati sono in corso di conferma per analisi di western blot. Il pattern di espressione proteica di BARD1 wild type e delle sue eventuali isoforme è stato analizzato con western blot in due linee cellulari tumorali derivate da tessuto mammario (MCF7) e da cervice uterina (HeLa). La rilevazione con l’anticorpo N19 mostra la presenza di tre bande all’altezza di 90, 40 e 33 KDa circa, mentre con il C20 di quattro bande, di 90, 40, 33 e 21 KDa circa. Il prodotto a 90 KDa è atteso per la proteina nativa, quello a 40 KDa per le isoforme trascritte dalle varianti RIN e delta. Il prodotto a 33 KDa potrebbe corrispondere ad un nuovo trascritto identificato per RT-PCR e sequenziamento diretto nelle MCF7 ed HeLa deleto dall’esone 4 all’esone 9. La banda a 21 KDa potrebbe essere un peptide BARD1 tronco dell’estremità N-terminale..
Questi dati suggeriscono quindi che almeno alcuni trascritti generati per splicing alternativo sono tradotti in proteina. Ulteriori esperimenti di western blot ed immunoistochimica sono in corso per confermare l’esistenza di queste isoforme ed le eventuali variazioni nel loro pattern di espressione in un gruppo di tumori mammari umani positivi e/o negativi per l’espressione del recettore per gli estrogeni e per la presenza di metastasi linfonodali.
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