• adiponectina
• AdipoR1
• AdipoR2
• ADN
• obesità
• Real time PCR
• T-caderina

Riassunto
Introduzione. Cancro, malattie cardiovascolari e diabete, che sono tra le principali cause di morbilità e mortalità nel mondo occidentale, mostrano fattori di rischio simili, primi fra tutti obesità e diabete. Sebbene i meccanismi che correlano le anomalie biochimiche della sindrome metabolica e lo sviluppo di malattie croniche restino largamente inesplorati, molti effetti sembrano essere legati all’azione endocrina del tessuto adiposo, che tramite la produzione di numerose sostanze biologicamente attive, le adipocitochine, modula l’infiammazione locale e sistemica, compromettendo il metabolismo d’organo e l’integrità del DNA.
Scopo. Scopo di questo lavoro di tesi è quello di valutare l’espressione, a livello di mRNA, dell’adiponectina (ADN), una adipochina con azione insulino-sensibilizzante e anti-infiammatoria, dei suoi recettori specifici (AdipoR1, AdipoR2, T-caderina) e delle principali vie del segnale ad essa associate (AMPKα1/2 e PPARα), in tessuti che rappresentano possibili bersagli di malattie croniche associate a obesità e diabete. Sono state inoltre valutate le variazioni di espressione di citochine infiammatorie, quali l’interleuchina (IL)-6 e il Tumor Necrosis Factor (TNF)α.
Materiali e Metodi. Sono stati studiati complessivamente 40 ratti maschi Zucker di 9-11 settimane suddivisi in quattro gruppi (n=10 ciascuno): 1. ratti obesi (O); 2. controlli magri (CO); 3. ratti diabetici (ZDF-D); 4. controlli magri (ZDF-CD). Gli animali sono stati studiati in condizioni di digiuno e di iperglicemia. Da ciascun animale è stato prelevato tessuto cardiaco, epatico e adiposo viscerale, per un totale di 120 campioni. L'RNA totale è stato estratto dai campioni tessutali e ne è stata verificata integrità, purezza e concentrazione. L’espressione a livello di mRNA degli effettori è stata valutata attraverso analisi Real-Time PCR previa messa a punto delle condizioni ottimali di reazione. Al fine di effettuare una corretta normalizzazione dei dati è stato valutato, per ciascun tessuto, un set di 10 geni di riferimento per selezionare quelli più stabili nel nostro modello sperimentale.
Risultati. Per il tessuto cardiaco i geni di riferimento selezionati sono risultati SDHA, TBP e HPRT1, per il tessuto epatico SDHA, GUSB e ACTB, per il tessuto adiposo TBP, TFRC e HPRT-1. Non sono state osservate variazioni significative dell’espressione di ADN in tutti i tessuti analizzati associate a obesità e diabete. Variazioni significative sono state osservate per i recettori specifici: l’AdipoR1 è risultato ridotto nel tessuto cardiaco dei ratti diabetici (p=0.0016); l’espressione dell’AdipoR2 è risultata aumentata nei ratti obesi (nel fegato, p=0.0007; nel tessuto adiposo, p=0.017) e ridotta nei ratti diabetici (nel tessuto epatico p=0.017; e cardiaco p=0.023). I livelli di mRNA di T-caderina sono risultati aumentati significativamente nell’obesità in tutti i tessuti analizzati: nel cuore (p=0.015), nel fegato (p<0.0001) e nel tessuto adiposo (p=0.0014). Non sono state osservate variazioni importanti nell’espressione dell’mRNA di AMPK-α1/2 e di PPARα mentre l’AMPK-α2 è risultata ridotta nel tessuto cardiaco dei ratti obesi (p=0.037) e nel tessuto epatico dei ratti diabetici (p=0.048). La condizione di digiuno o di iperglicemia non modificava l’espressione dei geni analizzati. L’espressione delle citochine infiammatorie è risultata aumentata nel tessuto adiposo (TNF-α, p=0.041; IL-6, p=0.017).
Conclusioni. I dati ottenuti sembrano indicare come obesità e diabete causino una significativa modificazione dell’espressione dei recettori dell’ADN, che, al contrario non risulta alterata in queste condizioni. Queste osservazioni suggeriscono come, in un contesto metabolico alterato, a rivestire maggiore importanza sia la capacità dei tessuti di legare la proteina. Questo è confermato dalla sovra-espressione, osservata nell’obesità in tutti i tessuti analizzati, della T-caderina, un co-recettore dell’ADN in grado di favorirne l’uptake tessutale. Questo dato suggerisce un possibile effetto compensatorio rivolto a aumentare gli effetti benefici dell’ADN in questa condizione.

Abstract
Title: Cardio-metabolic and inflammatory biomarker in a animal model of obesity

Introduction. Cancer, cardiovascular diseases and diabetes, which are the main causes of morbility and mortality in the western world, present similar risk factors, first of all obesity and diabetes. To date, the mechanisms which associate biochemical disorders of the metabolic syndrome to the development of chronic diseases are not fully understood, however the endocrine function of adipose tissue appears to have a central role. The fat produces a plenty of biological substances, the adipocytokines, which, regulating local and systemic inflammation, affect organ metabolism and DNA integrity.
Aim. Aim of this study was to evaluate the possible alterations of the system of adiponectin (ADN), an insulin-sensitizing and anti-inflammatory adipokine, in tissues known to be the target of chronic diseases associated to obesity and diabetes. For this, mRNA expression of ADN, of its specific receptors (AdipoR1, AdipoR2, T-cadherin) as well as of its principal intracellular signaling (AMPKα1/2 e PPARα) were determined. The mRNA expression of inflammatory cytokines, such as TNF-α and IL-6, was also evaluates.
Materials and Methods: The study included 40 male Zucker rats subdivided in four groups (n=10 each): 1. Zucker fatty rats (O); 2. control Zucker rats (CO); 3. Zucker diabetic fatty rats (ZDF-D); 4. control Zucker rats (ZDF-CD). The rats were studied both in fasting and in hyperglycemic conditions. Total RNA was extracted from tissue samples obtained from heart, liver and visceral adipose fat; RNA concentration, purity and integrity were determined. The mRNA expressions of the studied genes were evaluated by Real-Time PCR, after setting the optimal reaction conditions. Ten candidate reference genes were checked for each tissue and the three more stable selected for the normalization of real-time PCR data.
Results. The most stably expressed genes were: SDHA, HPRT-1 and TBP in cardiac tissue; SDHA, GUSB and ACTB in liver tissue; TBP, TFRC and HPRT-1 in visceral adipose tissue. No modification of ADN mRNA levels was found in the tissues of both obese and diabetic rats. Significant variations were observed for specific receptors: AdipoR1 mRNA level resulted decreased in cardiac tissue of diabetic rats (p=0.0016); AdipoR2 increased in obese rats in the liver (p=0.0007) and in the adipose tissue (p=0.017) while it decreased in diabetic rats in the liver (p=0.017) and in the heart (p=0.023). T-cadherin mRNA levels resulted significantly increased in all the tissues analyzed of obese rats: in the cardiac tissue (p=0.015), in the liver (p<0.0001), and in the visceral adipose tissue (p=0.0014). As regard to signaling pathways, no important modification was found for AMPK-α1/2 and PPARα while
AMPK-α2 decreased in the cardiac tissue in obese rats (p=0.037) and in the liver (p=0.048) of diabetic rats. Hyperglycemia or fasting condition did not changed the mRNA expression for all the analyzed genes. Inflammatory cytokine expression resulted increased in the visceral adipose tissue of obese rats (TNF-α, p=0.041; IL-6, p=0.017).
Conclusions. The results of this work indicate that the ADN system is modulated by obesity and diabetes mainly at the level of specific receptors. This suggests that, in a condition of metabolic alteration, the ADN uptake is of pivotal importance. This closely agrees with the up-regulation of T-cadherin, an ADN co-receptor that promote ADN uptake in tissues, found in all the analyzed tissues of obese rats. This observation suggests a possible compensatory effect devoted to increase the ADN beneficial effects in this metabolic condition.