• Alzheimer
• infiammazione
• inflammosoma
• NLRP3
• SAMP8

La malattia di Alzheimer è una patologia neurodegenerativa del SNC e rappresenta la causa più comune di demenza. Nei pazienti affetti da malattia di Alzheimer, a livello neuronale si evidenziano depositi di β-amiloide (Aβ) e di proteina Tau iperfosforilata. Tali depositi determinano alterazioni della barriera ematoencefalica e danni neuronali che portano all’attivazione di processi infiammatori. Tutte queste alterazioni determinano il manifestarsi nel paziente di deficit cognitivi e funzionali e cambiamenti comportamentali.
Numerose evidenze scientifiche suggeriscono che i disturbi neurologici sono spesso associati ad alterazioni funzionali gastrointestinali (GI), tra cui ridotta motilità intestinale, distensione addominale e stipsi, che hanno un impatto negativo sulla qualità della vita dei pazienti. L’accumulo di Aβ sembra verificarsi anche a livello intestinale e questo determina neuroinfiammazione periferica, alterazione del SNE e della motilità intestinale e potrebbe inoltre contribuire a neuroinfiammazione e neurodegenerazione nel sistema nervoso centrale. Tuttavia, attualmente non è possibile stabilire una relazione causale tra accumulo intestinale di Aβ e proteina Tau, infiammazione enterica e patologia di Alzheimer e sono necessarie quindi ricerche approfondite per chiarire come tali alterazioni possano contribuire allo sviluppo della neuroinfiammazione e della neurodegenerazione nel SNC.
Scopo dello studio: chiarire la relazione che si ha tra il deposito di Aβ a livello neuronale e la neuroinfiammazione, sia a livello centrale che periferico.
Valutare il coinvolgimento del sottotipo NLRP3 dell’inflammosoma nella patologia di Alzheimer.
Metodi:
- Animali: sono stati utilizzati topi maschi SAMP8 (Senescence Accelerated Mouse Prone 8), caratterizzati da senescenza accelerata ed il ceppo di controllo SAMR1 che presenta invece un declino cognitivo fisiologico. Gli animali sono stati usati a 6 mesi di età, in quanto caratterizzati da deficit cognitivo di grado intermedio, senza tuttavia manifestare i segni della malattia di Alzheimer conclamata.
Al momento del sacrificio sono stati prelevati campioni di colon e di cervello. È stato quindi valutato l’accumulo di Aβ a livello centrale (cervello) e periferico (colon e feci). Al fine di valutare la risposta infiammatoria sono stati determinati i livelli tissutali di IL-1β ed i marker di attivazione dell’inflammosoma (NLRP3, ASC e caspasi) nel cervello e nel colon.
- Colture cellulari: è stata utilizzata una linea cellulare di monociti umani (THP-1). In particolare sono state utilizzate cellule THP-1 normali (WT) e cellule THP-1 che non esprimono ASC (ASC-/-). Le cellule sono state seminate e trattate con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, 0.5 µM). Il giorno seguente, le cellule sono state trattate con LPS (1 µg/ml), in modo da aumentare l’espressione di pro-IL-1β e successivamente con nigericina (attivatore dell’inflammosoma NLRP3) o Aβ e/o YVAD (inibitore caspasi-1). Dopo l’incubazione per il tempo necessario i sovranatanti cellulari sono stati raccolti e le cellule lisate.
Abbiamo verificato come il trattamento con Aβ possa influenzare il rilascio di IL-1β e determinare l’attivazione dell’inflammosoma. Sono stati quindi valutati i livelli di IL-1β nei mezzi cellulari con kit immunoenzimatico e l’espressione della subunità ASC dell’inflammosoma tramite immunofluorescenza.
Risultati: i topi SAMP8 mostrano un aumento significativo di Aβ nel cervello e nelle feci rispetto al controllo SAMR1, al contrario nel colon non è sono state riscontrate alcune variazioni significative. Nel cervello e nel colon l’espressione della pro-caspasi non presentava differenze significative tra topi SAMP8 e SAMR1, mentre la caspasi risultava significativamente aumentata nei topi SAMP8. Nel cervello NLRP3 non mostrava differenze significative tra topi SAMP8 e SAMR1, mentre l’espressione di ASC risultava significativamente aumentata in topi SAMP8. Nel colon invece non sono state riscontrate alcune variazioni significative per entrambe le subunità dell’inflammosoma.
Nel cervello la concentrazione di IL-1β non mostrava variazioni significative tra topi SAMP8 e SAMR1 mentre nel colon è stato osservato un aumento significativo dei livelli di IL-1β nei topi SAMP8.
Sulle colture cellulari di cellule THP-1 sono stati determinati i livelli di IL-1β nei mezzi cellulari. È stato osservato, nel caso di trattamento con nigericina o Aβ, che le cellule WT rilasciano nel mezzo cellulare, IL-1β in quantità significativamente maggiori rispetto al trattamento con il solo LPS. Il trattamento con nigericina o Aβ associato all’inibitore della caspasi-1 (YVAD) determina una riduzione significativa del rilascio di IL-1β rispetto al trattamento con nigericina o Aβ, rispettivamente. Tuttavia, rispetto al trattamento con il solo LPS è stato osservato un aumento del rilascio di IL-1β che risultava essere significativo soltanto in seguito al trattamento con nigericina e YVAD.
Per quanto riguarda le cellule THP-1 ASC-/-, non è stato osservato alcun rilascio di IL-1β.
Sulle cellule THP-1 WT è stata anche determinata la morte cellulare tramite determinazione quantitativa di LDH. In questo caso, i livelli di LDH risultavano significativamente aumentati per tutti i trattamenti rispetto al trattamento con il solo LPS.
L’espressione della subunità ASC, valutata tramite immunofluorescenza, risultava significativamente aumentata nelle cellule trattate con nigericina e Aβ rispetto al trattamento con il solo LPS.
Conclusioni: la malattia di Alzheimer risulta associata ad un accumulo di Aβ a livello fecale, infiammazione periferica e centrale. Tali alterazioni potrebbero favorire il riarrangiamento del compartimento neuromuscolare e lo sviluppo di alterazioni della motilità intestinale osservate nella malattia di Alzheimer. Poiché il processo infiammatorio si verifica prima del completo sviluppo della malattia potrebbe rappresentare uno dei primi eventi della patologia.