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Riassunto
L’atrofia muscolare spinale (SMA) è una patologia autosomica recessiva caratterizzata dalla degenerazione dei motoneuroni del midollo spinale associata ad atrofia e paralisi muscolare e rappresenta una delle cause genetiche più frequenti di mortalità infantile. In base all’età di insorgenza dei sintomi, al grado di compromissione del sistema muscolare e all’età del decesso, la SMA si può suddividere in tre tipi. La forma acuta di tipo I (o di WERDNIG-HOFFMAN) è caratterizzata da una grave e generale debolezza muscolare alla nascita. La morte interviene nei primi 6 mesi di vita. Nel tipo II i bambini sono capaci di mantenere la postura quando sono seduti, ma non possono camminare da soli, e la sopravvivenza è di circa 2 anni. Nella SMA di tipo III (o di KUGELBERG-WELANDER), caratterizzata da una progressione più lenta, i pazienti presentano debolezza muscolare, che inizia dopo i 18 mesi cioè quando il bambino è già in grado di camminare ed allora si nota difficoltà nella corsa, nel salire le scale e nel rialzarsi da terra.
La degenerazione dei motoneuroni si verifica anche in una malattia dell’adulto nota come sclerosi laterale amiotrofica (SLA). Quest’ultima viene studiata estesamente dal punto di vista sperimentale, mentre i modelli sperimentali di SMA rimangono poco caratterizzati. In particolare, mancano modelli animali che siano studiati sia dal punto di vista motorio che morfologico. Questa carenza è critica in quanto non è possibile valutare gli eventuali effetti protettivi sulla degenerazione del motoneurone che avviene nella SMA. Per tale motivo nel presente studio di tesi abbiamo validato un modello sperimentale di SMA ed abbiamo confrontato la degenerazione del motoneurone in questo modello transgenico con quella ben documentata che avviene nel modello transgenico per la SLA (topo con mutazione SOD 1 di tipo G93A).
Il ceppo di topo utilizzato per la SMA possiede una delezione completa del gene smn1 (survival motor neuron) con eccesso compensatorio del gene smn2 in modo da validare un modello animale di SMA di tipo III; in particolare abbiamo voluto studiare se topi transgenici appartenenti al ceppo FVB con un genotipo Smn1 -/-, Smn2 +/+ e Smn1A2G +/- vanno incontro a deficit motori e morfologici sovrapponibili alla malattia di KUGELBERG-WELANDER (SMA III umana). I test motori, eseguiti per circa 10 mesi ogni 15 giorni, sono stati i seguenti: Rotarod test, Paw grip endurance test e stride length test. Il Rotarod test è uno dei più utilizzati per valutare le capacità motorie dell’animale e prevede l’uso di un cilindro rotante sul quale l’animale deve camminare per evitare di cadere. Nel Paw grip endurance test (PaGE test) viene valutata la capacità dell’animale di rimanere attaccato con le zampe ad una griglia di ferro capovolta. Lo stride length test, invece, consiste nel calcolare manualmente la lunghezza dei passi dell’animale, ovvero la distanza tra due impronte successive. Negli animali Smn1 -/-, Smn2 +/+ e Smn1A2G +/- abbiamo osservato un progressivo deterioramento delle funzioni motorie che venivano evidenziate particolarmente con il PaGE test che indica fedelmente la progressione della malattia.
Lo studio morfologico è stato effettuato su midolli spinali tagliati in sezioni sottili dello spessore di 7 µm e colorati con ematossilina-eosina; tali sezioni sono state utilizzate per valutare la presenza di alterazioni morfologiche e per analizzare il numero, la citoarchitettura e la morfometria dei motoneuroni della Lamina IX. In particolare, i motoneuroni della Lamina IX sono stati identificati in base alla loro classica morfologia (cellule multipolari con nucleo non condensato e nucleolo ben evidente) e alle dimensioni.
I dati ottenuti in morfologia ottica hanno evidenziato nei topi SMA una perdita di motoneuroni in Lamina IX, paragonabile a quanto si verifica nella SLA tuttavia la progressione del deficit motorio avviene con maggiore lentezza. Questo aspetto temporale simula la malattia umana e rende più facilmente misurabili nel tempo gli effetti di modificazione della progressione di malattia in seguito a trattamenti specifici. Le alterazioni morfologiche dei motoneuroni presentano caratteristiche comuni nei modelli transgenici di SLA e di SMA; in particolare i motoneuroni si presentano con dimensioni maggiori rispetto ai controlli. Questo aspetto si verifica quando il motoneurone va incontro a vacuolizzazione come in seguito a riduzione dei processi autofagici. Pertanto in uno studio ulteriore di prosecuzione della presente tesi vengono valutati gli effetti modulatori dell’autofagia sulla progressione dei sintomi motori e del processo neurodegenerativo.