• elettroporazione in utero
• microscopia a due fotoni
• microscopia confocale

Riassunto
Nel sistema nervoso centrale di mammifero, il sistema inibitorio rileva una vasta complessità morfo-funzionale ancora ampiamente inesplorata. La comprensione dell’eterogeneità tra le classi di interneuroni, la loro differente struttura, attività e signalling sinaptico sono alla base per l’analisi dell’equilibrio tra eccitazione ed inibizione nei networks nervosi, caratteristica essenziale che deve essere finemente regolata per evitare gravi conseguenze patologiche.
La sinapsi inibitoria utilizza come principale neurotrasmettitore il GABA (acido γ-ammino-butirrico) che per quanto riguarda l’elemento postsinaptico, può esercitare la sua azione sia su canali ionotropici (GABAA, GABAC) che metabotropici (GABAB). L’azione del GABA è stata per molto tempo ristretta alla modulazione dell’eccitabilità neuronale mediante iperpolarizzazione: recenti studi ipotizzano che, a differenza di quello che si osserva per il sistema nervoso centrale maturo, durante lo sviluppo il contenuto informazionale della trasmissione GABAergica è significativamente differente, mostrando una modulazione dal carattere depolarizzante. In particolare, questa caratteristica pare essere dovuta a una differente omeostasi dello ione cloruro, anione responsabile delle correnti generate all’apertura dei canali GABAA.
Il cloruro è infatti un anione chiave nella regolazione del potenziale di membrana e dell’attività elettrica della cellula, pertanto il suo equilibrio elettrochimico necessita di una precisa regolazione al fine di determinare se le correnti, generate dall’apertura di canali GABAA, siano depolarizzanti o iperpolarizzanti. Nelle cellule nervose il valore della concentrazione di questo ione dipende, oltre che da canali di leakage, anche dall’azione di due scambiatori: NKCC1 e KCC2. La variazione della loro espressione durante le diverse fasi dello sviluppo, determina cambiamenti nella concentrazione intracellulare di cloro, la quale si traduce in una differente regolazione della polarità di apertura del canale GABAA che in neuroni immaturi pare mediare l’attività eccitatoria, fornendo così gli adeguati stimoli per la maturazione, mentre in neuroni tardivi ha un’attività inibitoria strettamente correlata all’entrata in gioco del sistema glutammatergico (Shunting inibition ed effetto sinergico nella depolarizzazione).
Tutti i processi legati a variazioni di concentrazione di cloro intracellulare, sono ampiamente inesplorati causa limitazione dei correnti metodi di misurazione dei flussi di questo ione. Per iniziare a comprendere i meccanismi che stanno alla base di tali variazioni, sia in relazione agli stadi di sviluppo e quindi alla morfologia e funzione neuronale, si è utilizzato un nuovo sensore per il cloro codificato geneticamente e capace di fornire una precisa misura raziometrica della concentrazione di cloruro in relazione alle variazioni di pH. Tale indicatore, dal carattere non invasivo e quindi utilizzabile su substrati biologici, nasce dalla fusione di una variante della GFP (Green Fluorescent Protein) che ha un sito di legame per il cloro (Kd= 30 mM a pH 7.3), con un fluoroforo rosso (mDsRed) insensibile all’anione. Questo sensore (E 2 GFP-mDsRed) risulta essere importante perché permette oltre alla accurata misurazione di cloro e pH, una risoluzione spazio-temporale sufficiente allo studio dei processi biologici con rilevanza per l’analisi delle stesse durante lo sviluppo ed in eventuali modelli patologici di attività neuronale, per misurazioni delle variazioni locali di cloro e pH in differenti domini sub-cellulari e per lo studio di tali processi in vivo mediante imaging a due fotoni.
L’argomento della tesi vuole dunque essere un approccio all’analisi sia in vitro che in vivo di tali cambiamenti generati dall’azione dello ione cloruro nelle diverse fasi di età, monitorati tramite l’utilizzo del biosensore. Le misurazioni effettuate tengono in considerazione le caratteristiche spettroscopiche della GFP la quale sfrutta il fenomeno dello static quencing secondo cui il legame del cloro al cromoforo del sensore ne provoca lo spegnimento della fluorescenza. A tale scopo si sono svolti esperimenti di calibrazione in vitro a uno e due fotoni su cellule in coltura HEK 293 al fine di caratterizzare gli spettri di emissione ed eccitazione della molecola, sia in condizioni di variazione di pH e zero cloro che a concentrazioni di cloro note ma mantenendo fisso il pH. Analisi a due fotoni ci hanno inoltre permesso di evidenziare che, somministrando GABA tramite una micropipetta a cellule in coltura esprimenti il recettore GABAA e precedentemente trasfettate con il sensore, questo provoca apertura degli stessi canali e quindi aumento di cloro intracellulare inducendo così lo spegnimento del sensore stesso. Una volta confermata la possibilità di utilizzare il sensore per analisi a due fotoni, sono seguiti esperimenti in vivo attraverso l’utilizzo di due animali modello che sono il ratto (Wistar) e il topo (c57BlackSix-J). Si è pertanto clonato il DNA codificante per il sensore in uno specifico vettore plasmidico (pCAGGS-E2GFP-mDsRed) adatto per l’elettroporazione in utero, tecnica che consente di trasfettare in vivo subpopolazioni neuronali diverse in relazione con l’età embrionale.
Altra modalità per lo studio in vivo è quella di utilizzare un vettore virale Sindbis virus, appartenente alla famiglia Togaviridae che consentirà, grazie ad una massiccia espressione transiente, di studiare le variazioni di cloro durante le prime fasi di vita postnatale.
La variazione della concentrazione di cloro in relazione al suo equilibrio elettrochimico, verrà inoltre testato su colture primarie di neuroni corticali. Lo scopo di tali esperimenti sarà quello di rilevare la presenza di domini sub-cellulari relativi a gradienti di cloro discreti e dipendenti dalla somministrazione di concentrazioni di GABA note attraverso l’utilizzo di una micropipetta. Questo ci permetterà inoltre di fare misure per monitorare la variazione di voltaggio e conduttanza degli stessi canali attraverso la modalità di patch clamp, integrando così le conoscenze biochimiche con l’attività elettrica della cellula.