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Riassunto


La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) o malattia di Lou-Gehrig è una patologia neurodegenerativa che comporta la progressiva perdita dei motoneuroni a livello della corteccia motoria, del bulbo e del midollo spinale. Tra le ipotesi formulate riguardo le modalità di insorgenza della SLA, le più accreditate, oltre quella eccitotossica, chiamano in causa lo stress ossidativo e le alterazioni a carico del mitocondrio. Lo stress ossidativo descrive una condizione in cui si manifesta un’alterazione dell’ equilibrio fra la produzione delle specie chimiche reattive ossidanti e la loro degradazione da parte dei sistemi di difesa antiossidante. Tra le specie chimiche reattive, l’aumento intracellulare delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) provoca alterazione della struttura e della funzione delle membrane biologiche, danno al DNA, alle proteine e ai lipidi. Lo stress ossidativo sembra svolgere un ruolo patogenetico rilevante sia nel processo d’invecchiamento precoce che in alcune gravi patologie a sfondo infiammatorio e/o degenerativo. Infatti, il sistema nervoso centrale è altamente vulnerabile al danno ossidativo, a causa di un basso livello di enzimi antiossidanti, un elevato contenuto di substrati ossidabili e una gran quantità di ROS prodotte durante le reazioni neurochimiche. Inoltre, diversi lavori hanno dimostrato la presenza di un’ alterata concentrazione di glutammato nel plasma e nel liquido cerebrospinale di pazienti affetti da SLA e di topi portatori della mutazione G93A nel gene SOD1 , sottolineando che la sola esposizione delle cellule nervose alle ROS può provocare una riduzione del reuptake del glutammato da parte dei suoi trasportatori a livello gliale.
Queste evidenze hanno suggerito di valutare se l’ aumentata concentrazione del glutammato sia una conseguenza dell’alterato equilibrio redox o se vi sia un fattore di suscettibilità genetica che possa essere associato alla ridotta attività di reuptake del neurotrasmettitore.
Il presente lavoro di tesi si sviluppa in due fasi sperimentali: nella prima si propone di valutare i livelli plasmatici di alcuni marcatori di stress ossidativo in 32 pazienti con SLA sporadica (13/19 M/F, età media 63.3±10.8 anni) all’esordio della malattia e in 54 controlli sani (25/29 M/F, età media 69.3±9.2 anni) reclutati nell’ambito di uno studio condotto presso il Dipartimento di Neuroscienze dell’Università di Pisa.
Nella seconda fase sperimentale, l’obiettivo è stato quello di ricercare un possibile fattore di suscettibilità genetica che possa determinare, oltre al danno ossidativo, l’alterazione del reuptake del glutammato.
A tale scopo è stato analizzato il gene che codifica per il trasportatore del glutammato EAAT2 (GLT-1), che provvede a rimuovere più del 90% del glutammato totale; esso sembra giocare un ruolo centrale nei meccanismi di eccitotossicità. In particolare è stato analizzato il polimorfismo -181 A/C, associato con una ridotta attività trascrizionale del gene che codifica per il trasportatore del glutammato, con conseguente riduzione della produzione della proteina.
Lo studio di associazione tra il polimorfismo in esame e la SLA ha previsto l’analisi di un totale di 130 pazienti, di cui 87 uomini e 43 donne con un’età media di 64.2±10.5 anni, e i relativi controlli sani.
La valutazione della risposta cellulare all’insulto ossidativo è stata effettuata tramite la determinazione di marcatori periferici di danno alle proteine (AOPP), la determinazione della capacità ferro riducente del plasma (FRAP) e la determinazione dei tioli plasmatici (-SH) tramite l’utilizzo di tecniche spettrofotometriche.
Le analisi di biologia molecolare previste in questo lavoro di tesi sono state
condotte con l’applicazione della tecnica “Restriction Fragment Lenght Polymorphism” (RFLP).