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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-09042023-165223


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
DRAGO, DAVIDE LORENZO
URN
etd-09042023-165223
Titolo
Caratterizzazione di nicchie neurogeniche adulte in cervelli di pesci cartilaginei
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Relatori
relatore Prof. Cellerino, Alessandro
Parole chiave
  • adult neurogenesis
  • chondrichthyes
  • condroitti
  • glia radiale
  • neurogenesi adulta
  • neurogenic niches
  • nicchie neurogeniche
  • radial glia
Data inizio appello
19/09/2023
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
19/09/2093
Riassunto
Caratterizzazione di nicchie neurogeniche adulte in cervelli di pesci cartilaginei.
La neurogenesi è il processo di intensa proliferazione con cui si generano le cellule del sistema nervoso durante lo sviluppo embrionale. Questo fenomeno nei mammiferi si riduce drasticamente nelle fasi successive allo sviluppo; tuttavia, negli ultimi venti anni molti studi hanno mostrato la persistenza di nicchie neurogeniche attive in almeno due zone del cervello di topo, la Sub Granular Zone e la Sub Ependymal Zone, sebbene esse abbiano un’attività molto limitata. In seguito, è stato osservato che il processo di neurogenesi adulta in altri gruppi di animali, quali i pesci ossei, è decisamente più persistente.
L’interesse principale della mia ricerca sperimentale è realizzare uno studio comparativo dei processi della neurogenesi adulta in alcune specie di condroitti come modello basale dell’albero filogenetico dei vertebrati, al fine di svelare eventuali aspetti comuni con animali filogeneticamente distanti come i mammiferi, che ci consentano di evidenziare aspetti e potenzialità di alcuni geni e molecole-chiave nella regolazione dei processi e delle funzioni neurali (neurogenesi, neurodegenerazione, rigenerazione).
Sebbene siano state descritte le nicchie neurogeniche di pesci teleostei come Danio rerio e Nothobranchius furzeri, sono ancora poche le descrizioni di nicchie neurogeniche in pesci cartilaginei come Scyliorhinus canicula (gattuccio) e in particolare sono assenti per le specie Raja Asterias (razza), Torpedo Marmorata (torpedine) e Chimaera monstrosa (chimera). Con il mio lavoro di tesi, ho voluto realizzare una prima approfondita caratterizzazione delle nicchie neurogeniche adulte in queste specie, utilizzando tecniche di immunofluorescenza e di ibridazioni in situ.
Ho usato la tecnica della immunofluorescenza nella razza, nella torpedine e nella chimera, utilizzando anticorpi diretti contro le seguenti proteine: Proliferative Cellular Nuclear Antigen (PCNA) che marca le cellule proliferative, S100β, che marca le cellule della glia radiale, Musashi1 (Msi1), classico marcatore dei progenitori neuronali, e istone H3 fosforilato (pH3) per marcare le cellule in mitosi. Inoltre, in R. asterias ho effettuato delle ibridazioni in situ (ISH) per marcare dei target per il quale non sono presenti in commercio anticorpi efficaci su questa specie. Ho utilizzato le ISH per marcare i trascritti dei geni NOTCH1, marcatore di cellule staminali neurali attive; NOTCH3, marcatore di cellule staminali neurali quiescenti; SOX2, marcatore di cellule staminali neurali e di progenitori neurali.
I risultati delle marcature mostrano che l’attività neurogenica in R. asterias è concentrata principalmente attorno ai ventricoli ai livelli di telencefalo e mesencefalo, sebbene siano presenti cellule proliferanti sparse nel parenchima. Al livello del cervelletto invece si individuano 8 nicchie, di cui 3 lungo l’asse dorso-mediale, e 5 lateralmente. Le cellule staminali che si trovano nel telencefalo e nel mesencefalo sono quasi tutte S100β+/PCNA+, quindi cellule della glia radiale, mentre nel cervelletto molte cellule sono S100β-/PCNA+, segno che queste cellule potrebbero essere di tipo neuroepiteliale. Nel mesencefalo è inoltre presente un grande accumulo di cellule NOTCH1+/NOTCH3+/SOX2+. Agglomerati di cellule SOX2+ sono inoltre presenti nel parenchima di telencefalo e mesencefalo; tuttavia, i tipi cellulari positivi a queste marcature richiedono successivi approfondimenti per essere caratterizzati con maggior precisione.
In Torpedo marmorata, similmente alla razza, osserviamo cellule S100β+/PCNA+ attorno al ventricolo per tutta la sua lunghezza, fino ad arrivare all’estremità più caudale di esso, situata nel Lobus Eelectricus, dove la marcatura si fa nettamente meno intensa. Similmente alla razza, si possono riscontrare cellule PCNA+ al di fuori della nicchia, nell’area periventricolare e nel parenchima.
Infine, in Chimaera monstrosa, sono presenti delle cellule staminali attorno ai ventricoli, ma pochissime di esse risultano attive. Le cellule PCNA+ sono presenti in numero bassissimo. È invece riscontrabile, proprio attorno ai ventricoli, un’elevata presenza di aggregati di Lipofuscina, un prodotto dei processi di perossidazione lipidica e proteica, comunemente utilizzato come marker di invecchiamento, accumulandosi progressivamente nella cellula. Quale sia il motivo dell’accumulo di lipofuscina in questa specie e se questo sia collegato con l’età rimane ancora incerto; successive investigazioni per mettere in correlazione età e accumulo del marker di invecchiamento potranno essere realizzate in futuro tramite l’applicazione di metodi di quantificazione cronologica già standardizzati, come la misura del radiocarbonio all’interno del cristallino.
L’insieme di queste osservazioni preliminari e di una loro interpretazione su base comparativa con altre specie di vertebrati è fondamentale per comprendere più a fondo il fenomeno della neurogenesi adulta negli Gnatostomi basali, così da capire meglio come questo fenomeno si sia evoluto lungo l’albero filogenetico dei vertebrati. Le conoscenze che emergono dalle mie investigazioni forniscono una base essenziale per poter promuovere una ricerca approfondita della neurobiologia di questi organismi, indirizzando al meglio studi funzionali futuri sul ruolo e le potenzialità fisiologiche di fattori e geni-chiave (geni NOTCH, neurotrofine) dei processi neurali più importanti, e offrendo nel tempo un alto potere traslazionale nella ricerca di terapie efficaci anche per l’uomo.

Characterization of adult neurogenic niches in cartilaginous fish brains.
Neurogenesis is the process of intense proliferation by which cells of the nervous system are generated during embryonic development. This phenomenon in mammals is drastically reduced in the post-developmental stages; however, over the past twenty years many studies have shown the persistence of active neurogenic niches in at least two areas of the mouse brain, the Sub Granular Zone (SGZ) and the Sub Ependymal Zone (SEZ), although they have very limited activity. Later, it was observed that the process of adult neurogenesis in other groups of animals, such as bony fish, is significantly more persistent.
The main interest of my experimental research is to carry out a comparative study of the processes of adult neurogenesis in some species of chondrichthyes as a basal model of the vertebrate phylogenetic tree, in order to unveil possible commonalities with phylogenetically distant animals such as mammals, which would allow us to highlight aspects and potentials of some key genes and molecules in the regulation of neural processes and functions (neurogenesis, neurodegeneration, regeneration).
Although the neurogenic niches of teleost fishes such as Danio rerio and Nothobranchius furzeri have been described, there are still few descriptions of neurogenic niches in cartilaginous fishes such as Scyliorhinus canicula (dogfish) and in particular they are absent for the species Raja Asterias (ray), Torpedo Marmorata (torpedo) and Chimaera monstrosa (chimera). With my thesis work, I wanted to perform a first thorough characterization of adult neurogenic niches in these species, using immunofluorescence and in situ hybridization techniques.
I used the immunofluorescence technique in stingray, torpedo, and chimera, using antibodies directed against the following proteins: Proliferative Cellular Nuclear Antigen (PCNA), which marks proliferative cells; S100β, which marks radial glia cells; Musashi1 (Msi1), a classic marker of neuronal progenitors; and phosphorylated histone H3 (pH3) to mark cells in mitosis. In addition, in R. asterias I performed in situ hybridizations (ISHs) to mark targets for which there are no commercially available effective antibodies on this species. I used ISHs to mark transcripts of the genes NOTCH1, marker of active neural stem cells; NOTCH3, marker of quiescent neural stem cells; SOX2, marker of neural stem cells and neural progenitors.
Marking results show that neurogenic activity in R. asterias is mainly concentrated around the ventricles at the telencephalon and midbrain levels, although proliferating cells scattered throughout the parenchyma are present. At the level of the cerebellum, on the other hand, 8 niches are identified, including 3 along the dorso-medial axis, and 5 laterally. The stem cells found in the telencephalon and midbrain are almost all S100β+/PCNA+, thus radial glia cells, whereas in the cerebellum many cells are S100β-/PCNA+, a sign that these cells might be neuroepithelial type. In the midbrain there is also a large accumulation of NOTCH1+/NOTCH3+/SOX2+ cells. Agglomerates of SOX2+ cells are also present in the parenchyma of the telencephalon and midbrain; however, cell types positive for these markings require further investigation to be characterized more precisely.
In Torpedo marmorata, similarly to the skate, we observe S100β+/PCNA+ cells around the ventricle along its entire length, down to the most caudal end of it, located in the Lobus Eelectricus, where the marking becomes markedly less intense. Similar to the race, PCNA+ cells can be found outside the niche, in the periventricular area and in the parenchyma.
Finally, in Chimaera monstrosa, stem cells are present around the ventricles, but very few of them are active. PCNA+ cells are present in very low numbers. On the other hand, a high presence of aggregates of Lipofuscin, a product of lipid and protein peroxidation processes, commonly used as a marker of aging, can be found right around the ventricles, progressively accumulating in the cell. What is the reason for the accumulation of lipofuscin in this species and whether this is related to age still remains uncertain; subsequent investigations to correlate age and accumulation of the aging marker may be carried out in the future through the application of already standardized methods of chronological quantification, such as the measurement of radiocarbon within the lens.
The combination of these preliminary observations and an interpretation of them on a comparative basis with other vertebrate species is essential for a deeper understanding of the phenomenon of adult neurogenesis in basal Gnathostomes, so as to better understand how this phenomenon has evolved along the vertebrate phylogenetic tree. The knowledge emerging from my investigations provides an essential basis for being able to promote in-depth research of the neurobiology of these organisms, best directing future functional studies on the role and physiological potential of key factors and genes (NOTCH genes, neurotrophins) of major neural processes, and offering high translational power in the search for effective therapies for humans as well.
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