• Alzheimer
• microglia
• RAGE

RIASSUNTO
La malattia di Alzheimer (AD) è una patologia neurodegenerativa cronica con meccanismi fisiopatologici ben definiti; inizialmente colpisce le strutture mediali del lobo temporale, quali l'ippocampo e la corteccia entorinale (EC) per poi diffondersi alle altre strutture corticali. Le principali caratteristiche istopatologiche della malattia sono rappresentate dalle placche neuritiche e dai grovigli neurofibrillari, che sono, rispettivamente, correlate all'accumulo extracellulare del peptide β-amiloide (Aβ) e ai cambiamenti del citoscheletro derivanti dall’iperfosforilazione della proteina associata ai microtubuli Tau.
Il nostro studio è stato incentrato sulla EC, una regione paraippocampale coinvolta nell'apprendimento e nella memoria e che mostra un alto grado di plasticità neuronale. Studi recenti condotti nel modello murino che esprime mutazioni umane del gene della proteina precursore dell'amiloide (mhAPPJ20), hanno evidenziato una disfunzione specifica del circuito cortico-ippocampampale. In particolare è stato dimostrato come la neurodegenerazione si diffonda attraverso le connessioni tra EC ed ippocampo. Il nostro obiettivo è stato quello di descrivere l'andamento temporale delle alterazioni della EC, nei topi mhAPPJ20 a diverse stadi di neurodegenerazione. A questo scopo abbiamo registrato potenziali di campo extracellulare nella circuiteria intrinseca dello strato superficiale della EC, utilizzando il preparato in vitro di fettine cerebrali. Inoltre, utilizzando dei test di memoria che si basano sul riconoscimento di oggetti quali novel object recognition task, novel object place recognition task e novel object place context recognition task (ORT, OPRT e OPCRT), abbiamo valutato se i deficit di plasticità sinaptica fossero associati a deficit comportamentali. I nostri studi precedenti hanno dimostrato come la somministrazione esogena di Aβ sia in grado di inibire la plasticità sinaptica dello strato superficiale della EC. Inoltre, abbiamo dimostrato che questo effetto è mediato dal recettore RAGE che interagendo con la Aβ attiva vie di trasduzione del segnale legate allo stress. In particolare RAGE espresso nelle cellule microgliali è in grado, una volta stimolato dalla Aβ, di attivare un processo pro-infiammatorio che contribuisce alla sviluppo delle alterazioni della funzione sinaptica nella EC.
Nel presente lavoro abbiamo studiato il ruolo di RAGE utilizzando topi transgenici ottenuti incrociando la linea mhAPPJ20 con topi che esprimono, in modo selettivo nella microglia, una forma dominante negativa del recettore (DNMSR). I nostri risultati dimostrano come la plasticità sinaptica, in particolare l'espressione di potenziamento a lungo termine (LTP), sia compromessa nello strato superficiale dell’EC di topi mhAPP-J20 già ad uno stadio precoce di neurodegenerazione, corrispondente a 2 mesi di età. Tuttavia a questa età non si osservano nelle fettine ottenute da topi mhAPP-J20 variazioni significative, rispetto ai controlli non transgenici, sia nella trasmissione sinaptica di base che nell'espressione dell'altra principale forma di plasticità sinaptica, la depressione a lungo termine (LTD). Ad uno stadio successivo di neurodegenerazione, ovvero a 6 mesi di età, la funzione sinaptica nella EC dei topi mhAPP-J20 risulta ulteriormente compromessa, come evidenziato da una riduzione della forza nella trasmissione sinaptica di base e dall’assenza della espressione di LTD. L’analisi comportamentale eseguita utilizzando l’OPRT e l’OPCRT, due test di memoria associativa dipendenti dalla integrità funzionale della EC, ha inoltre dimostrato che le alterazioni elettrofisiologiche sono associate a un deficit comportamentale nei topi mhAPP-J20 di 2 mesi di età. Mentre, con il progredire della neurodegenerazione, il deficit di memoria si aggrava ed è evidenziabile anche nel test non-associativo (ORT). Al contrario, i dati ottenuti utilizzando i topi doppi transgenici (mhAPPJ20xDNMSR) dimostrano che i deficit sinaptici e comportamentali osservati nei singoli transgenici mhAPPJ20 possono essere recuperati sia a 2 mesi che a 6 mesi di età attraverso l’inibizione selettiva di RAGE nella microglia. Inoltre, i risultati ottenuti in singoli topi transgenici DNMSR dimostrano che l'inibizione selettiva di RAGE nella microglia non è in grado di alterare la funzione sinaptica e il comportamento dipendente dalla EC. Nel loro insieme i nostri risultati confermano un preciso ordine cronologico nel coinvolgimento della EC durante il progressivo accumulo di Aβ ed evidenziano il contributo del recettore pro-infiammatorio RAGE in una fase iniziale della neurodegenerazione nel modello murino mhAPPJ20.

ABSTRACT
Alzheimer’s disease (AD) is a chronic neurodegenerative disorder with well-defined pathophysiological mechanisms, which is initially restricted to the medial temporal lobe structures, such as hippocampus and entorhinal cortex (EC) and then spreading to other neocortical areas. Neuritic plaques and neurofibrillary tangles represent the major histopathological hallmarks of the disease, and are respectively related to the extracellular accumulation of the amyloid-beta peptide (Aβ), and to cytoskeletal changes resulting from the hyperphosphorylation of microtubule-associated protein Tau.
We focused our study on the EC, a parahippocampal brain region involved in learning and memory and exhibiting a high degree of plasticity. In particular cortico hippocampal network dysfunction has been reported in a mouse model expressing human mutations of the amyloid precursor protein gene (mhAPPJ20), suggesting a spreading of neuronal dysfunction within the EC/hippocampal connections. Our aim was to investigate the time course of EC dysfunction in mhAPPJ20 mice in relation to the progressive accumulation of Aβ, corresponding to different stages of neurodegeneration. To this aim we record extracellular field potential in the intrinsic circuitry of EC superficial layer using in vitro brain slices. Moreover, using an associative memory task based on object recognition we evaluated whether synaptic plasticity deficits where associated with a behavioral impairment.
Our previous studies demonstrated that exogenously applied Aβ affects synaptic plasticity of superficial layer of the EC. More importantly we demonstrated that this effect are mediated by cell surface receptor RAGE interacting with Aβ and activating specific signal transduction pathways. In particular RAGE expressed in microglial cell has a prominent role in the activation of a proinfiammatory pathway contributing to Aβ dependent EC synaptic dysfunction.
In the present work we investigated the role of RAGE using double transgenic mice obtained crossing mhAPPJ20 with mice expressing a dominant negative form of the receptor that was targeted to microglia (DNMSR).
Our results show that synaptic plasticity, in particular the expression of long-term potentiation (LTP), is impaired in the EC superficial layer of hAPP-J20 mice, at an early stage of neurodegeneration, i.e. 2 months of age. LTP was specifically altered as basic synaptic transmission and the expression of the other main form of synaptic plasticity, the long-term depression (LTD), were not affected. Moreover, al later stage of neurodegeneration, i.e. 6 months, we observed more complex synaptic deficit, involving LTD impairment and a reduced strength in basic synaptic transmission. These electrophysiological evidences were associated with behavioural deficit as assessed using the OPRT and OPCRT . The results obtained in single transgenic DNMSR mice demonstrate that selective inhibition of RAGE in microglia did not affect either synaptic function or EC-dependent behaviour . More importantly a complete rescue of synaptic and behavioural deficits were observed either at 2 months or 6 months of age in the double transgenic (mhAPPJ20xDNMSR) mice compared to age-matched single mhAPPJ20 mice. Thus, EC dysfunction induced by overexpression of Aβ is an early sign of neurodegeneration that can be prevented by functional suppression of RAGE in microglia. Our findings support the hypothesis of a precise hierarchical order of involvement of different circuitries during the progressive accumulation of Aβ and highlight the contribution of RAGE-dependent inflammatory pathway at an early stage of neurodegeneration in the mhAPPJ20 mouse model.