• GSTO1-1
• NET
• LES

Le Glutatione Transferasi (GST) costituiscono una superfamiglia di enzimi primariamente coinvolti nei processi di detossificazione. Negli ultimi anni, numerose evidenze sperimentali hanno permesso di identificare nuove funzioni biologiche per le GST e la superfamiglia si è arricchita di nuove componenti, incluse le Glutatione Transferasi di classe Omega (GSTO).
Le transferasi appartenenti alla classe Omega mostrano caratteristiche peculiari sia dal punto di vista strutturale che funzionale. Nell'uomo esistono due forme di GSTO, la GSTO1-1 e la GSTO2-2, che rivestono grande importanza nella risposta allo stress cellulare, nella sintesi e nell’attivazione post-traduzionale dell'interleuchina 1 e nella modulazione del rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico. In generale, le GSTO hanno un ruolo proinfiammatorio, antiapoptotico e proautofagico. Numerosi studi si sono focalizzati sul possibile ruolo della GSTO1-1 in differenti contesti patologici di tipo neoplastico ed infiammatorio. In quest’ultimo caso, l’attività enzimatica della GSTO1-1 sembra essere necessaria per aumentare la quantità di ROS nel citoplasma dei macrofagi e per l’attivazione della via di NF-κB, presumibilmente modulando reazioni di glutatiolazione. La GSTO1-1 è stata inoltre rilevata all’interno dei Neutrophil Extracellular Traps (NET) liberati dai neutrofili attivati durante il processo di NETosi, anche se meccanismo e significato di questo fenomeno non sono ancora stati chiariti.
Sulla base di queste premesse, lo Scopo di questa Tesi è stato quello di valutare se la GSTO1- 1 potesse avere un qualche ruolo nella formazione dei NET e i meccanismi coinvolti oppure se, al contrario, la sua presenza all'interno dei NET fosse solo un epifenomeno associato all’attivazione neutrofilica.
Inizialmente sono state messe a punto le condizioni sperimentali idonee per studiare l'attivazione neutrofilica in vitro utilizzando neutrofili isolati da sangue di donatori sani e da pazienti affetti da lupus eritematoso sistemico (LES). Esperimenti preliminari hanno consentito di individuare tempi di incubazione e concentrazioni di stimoli attivanti - quali lipopolisaccaride (LPS), forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) e calcio ionoforo A23187 - e di specifici inibitori - quali chelanti del calcio (BAPTA; EGTA), inibitori della PKC (staurosporina (ST)) e della polimerizzazione dei filamenti di actina (citocalasina B (CyB)).
Successive determinazioni condotte al microscopio a fluorescenza hanno quindi consentito di osservare che trattamenti con LPS e PMA - oltre a stimolare l'attivazione neutrofilica - sono in grado di indurre la traslocazione nucleare di GSTO1-1, pur non variandone l'espressione. Dati ancora preliminari suggeriscono che il fenomeno possa essere modulato dai variati livelli di calcio intracellulare e dall'attivazione della PKC, visto che chelanti del calcio come BAPTA ed inibitori della PKC come la staurosporina sono in grado di inibire l'effetto osservato. È probabile che la traslocazione nucleare della GSTO1-1 rientri nel quadro delle sue funzioni regolatrici nella risposta adattativa allo stress cellulare, inclusa l'attivazione neutrofilica, ma è
al tempo stesso il passaggio che ne consente la successiva localizzazione nei NET rilasciati. In effetti, l'analisi al microscopio a fluorescenza ha confermato la presenza di GSTO1-1 nei NET extracellulari.
Viste le funzioni regolatrici che la GSTO1-1 espleta su meccanismi generali della risposta cellulare - in particolare tramite la modulazione dei livelli di glutationilazione di proteine di segnale (NF-κB, NLRP3) e strutturali (actina) - è tuttavia possibile che la GSTO1-1 possa modulare il fenomeno stesso della NETosi. I dati ottenuti sembrano in effetti supportare questa ipotesi. Abbiamo infatti osservato che un inibitore specifico di GSTO1-1 (C1-27) è in grado di ridurre la formazione di NET sia in neutrofili isolati da donatori sani che in neutrofili isolati da pazienti LES. Se confermati, questi dati documenterebbero per la prima volta il possibile coinvolgimento dell'attività enzimatica della GSTO1-1 nella modulazione del processo di NETtosi, anche se non chiariscono ancora il meccanismo coinvolto. Dati ancora molto preliminari sembrano escludere variati livelli di tiolazione dell'actina dipendenti da GSTO1-1, ma ulteriori e più approfonditi esperimenti sono necessari per comprendere il meccanismo coinvolto.
Il rilascio di GSTO1-1 assieme ai NET, oltre ad essere interessante per comprendere i fattori coinvolti in questo particolare tipo di morte cellulare, è potenzialmente interessante anche per le possibili ricadute che potrebbe avere da un punto di vista diagnostico. Se infatti la GSTO1- 1 viene rilasciata in seguito ad attivazione neutrofilica, è ipotizzabile che possa poi essere rilevata nei liquidi biologici, soprattutto in condizioni patologiche che si associano a intensa NETosi. In effetti, l'analisi di un piccolo gruppo di campioni di plasma ha permesso di individuare livelli significativamente più alti di GSTO1-1 e di auto-anticorpi anti-GSTO1-1 in soggetti LES rispetto ai soggetti sani di controllo.
Seppur ancora preliminari, i dati raccolti rafforzano il messaggio presente in letteratura dell'importante coinvolgimento della GSTO1-1 nella regolazione della risposta immunitaria. La regolazione funzionale proposta per la GSTO1-1 nel caso dell'attivazione macrofagica sembra avere un senso anche nel caso dei neutrofili, altra importante componente della risposta immunitaria innata, e coinvolgerebbe fenomeni di traslocazione nucleare e regolazione della NETosi. Altri esperimenti sono tuttavia necessari sia per aumentare la numerosità campionaria – e superare così il problema della variabilità biologica osservata – sia per indagare al meglio i possibili meccanismi regolati.
Una migliore comprensione del possibile ruolo regolatorio della GSTO1-1 nell'attivazione neutrofilica aiuterebbe a comprendere meglio i meccanismi che modulano l'attivazione della risposta immunitaria e renderebbe ancora più giustificata la ricerca di specifici inibitori per potenziali usi terapeutici.