• prostate cancer
• miRNA
• miR-96-5p
• miR-210-3p
• miR-183-5p
• exosomes
• drug resistance in cancer
• docetaxel resistance
• cancro alla prostata
• resistenza al docetaxel

RIASSUNTO
Lo sviluppo della resistenza ai chemioterapici è una delle maggiori criticità nel trattamento di pazienti oncologici. Dal 2010 il docetaxel (DCT) è il gold standard per il trattamento del cancro alla prostata resistente alla castrazione (CRPC). Purtroppo la maggior parte dei pazienti sviluppa resistenza al farmaco dopo circa un anno dall’inizio della terapia. Pertanto è importante indagare i meccanismi che possono influenzare la sensibilità al farmaco. In particolare, in questa tesi, è stato indagato il ruolo di alcuni miRNA specificamente rilasciati da cellule di carcinoma prostatico (PCa) resistenti al DCT nel modificare la sensibilità al farmaco in due linee cellulari di PCa (22Rv1, androgeno dipendente, e DU-145, androgeno indipendente). I miRNA presi in esame sono stati il miR-96-5p, il miR-183-5p e il miR-210-3p (DCTR-miRNA).
I DCTR-miRNA, se overespressi nelle linee 22Rv1 e DU-145, determinano una significativa diminuzione della sensibilità al DCT. Per comprendere attraverso quali target diretti i DCTR-miRNA regolino la risposta al DCT, sono stati considerati i loro target validati depositati in miRTarBase. Per ogni miRNA è stata eseguita una “gene enrichment analysis” (GEA) utilizzando diversi database e sono stati estrapolati i target dai pathway significativamente arricchiti. Questi sono stati ulteriormente selezionati in base alla funzione e al loro livello di espressione nelle cellule di PCa resistenti al DCT, ottenendo una lista di 21 geni. Per dimostrare che i DCTR-miRNA sono in grado di regolare i target selezionati, la loro espressione è stata valutata nelle DU-145 in seguito all’overespressione dei DCTR-miRNA, con o senza trattamento con DCT. La maggior parte dei target selezionati sono risultati downregolati dai DCTR-miRNA. Fra i target downregolati sono stati selezionati i geni TP53INP1, PPP2CB e INSIG1, la cui espressione è stata silenziata nelle DU-145, in seguito trattate con diverse dosi di DCT. Dalle curve ottenute TP53INP1 e PPP2CB sono risultati mediatori rispettivamente dell’azione del miR-96-5p e del miR-183-5p.
Poiché è noto che nel microambiente tumorale (TME) le cellule resistenti ai chemioterapici rilasciano segnali, come i miRNA, in grado di influenzare la chemiosensibilità delle cellule circostanti, abbiamo valutato il ruolo dei DCTR-miRNA come messaggeri extracellulari. Per questo sono stati isolati gli esosomi dal mezzo di crescita di alcuni cloni resistenti al DCT e utilizzati per trattare le rispettive cellule parentali (22Rv1 o DU-145). I risultati hanno evidenziato che il trattamento con gli esosomi dei cloni determinava una significativa diminuzione della sensibilità al farmaco. Per verificare che questo effetto dipendesse dai DCTR-miRNA, le cellule 22Rv1 e DU-145 sono state esposte a esosomi arricchiti di uno dei DCTR-miRNA, singolarmente o miscelati insieme. L’esposizione alla miscela di esosomi ha comportato una diminuzione della sensibilità al DCT in entrambe le linee cellulari suggerendo che i DCTR-miRNA veicolati da esosomi sono in grado di modulare la risposta al DCT di cellule sensibili al farmaco, agendo probabilmente in maniera sinergica. Ugualmente l’esposizione delle 22Rv1 e delle DU-145 al mezzo condizionato da cellule trasfettate contemporaneamente con i tre DCTR-miRNA ha comportato una diminuzione della sensibilità cellulare al farmaco.
In conclusione i dati ottenuti suggeriscono che: a) i DCTR-miRNA, se overespressi in cellule di PCa, diminuiscono significativamente la sensibilità cellulare al DCT; b) i DCTR-miRNA modulano la risposta al DCT tramite la regolazione negativa di TP53INP1 e PPP2CB che sono mediatori dell’azione del miR-96-5p e del miR-183-5p rispettivamente; c) i DCTR-miRNA possono anche agire da messaggeri extracellulari, probabilmente in modo sinergico, determinando una diminuzione della citotossicità del DCT in cellule di PCa a loro esposte.

ABSTRACT
Chemoresistance is the most critical issue in the treatment of cancer patients, including prostate cancer (PCa). Since 2010, the gold standard therapy for castration-resistant prostate cancer (CRPC) was docetaxel (DCT) chemotherapy. Unfortunately, most patients develop DCT resistance within one year from the beginning of the therapy. Therefore, it is important to investigate the mechanisms that can affect the sensitivity to this drug. In this work, we investigated the role of the miRNAs released by DCT resistant PCa cells in affecting DCT sensitivity of two prostate cancer cell lines (22Rv1, androgen-dependent, and DU-145, androgen-independent). Particularly, we focused on miR-96-5p, miR-183-5p and miR-210-3p (named DCTR-miRNAs).
DCTR-miRNAs overexpression in 22Rv1 and DU-145 cells significantly decreases the sensitivity to DCT. To understand which direct targets are the mediators of the DCTR-miRNAs-dependent modulation of DCT response, we considered their validated targets reported by miRTarBase. For each DCTR-miRNA, we conducted the gene enrichment analysis (GEA) using different databases and we identified the targets belonging to the significantly enriched pathways. Among them we selected those downregulated in DCT resistant PCa cells and whose function was consistent with the known mechanisms of DCT resistance, obtaining a list of 21 genes. To evaluate whether DCTR-miRNAs can regulate the selected target genes, we analyzed their gene expression levels in DU-145 cells after DCTR-miRNAs overexpression, with or without DCT treatment. Most of the selected targets were downregulated by DCTR-miRNAs. Among them we selected TP53INP1, PPP2CB and INSIG1 genes whose expression was silenced in DU-145 cells. The results suggested that TP53INP1 and PPP2CB are mediators of the activity of miR-96-5p and miR-183-5p respectively.
It is known that in the tumor microenvironment (TME) drug-resistant cells release signals such as miRNAs than can affect the drug sensitivity of surrounding cells. Therefore, we evaluated the role of DCTR-miRNAs as extracellular messengers. For this purpose, we isolated the exosomes from the growth medium of the DCT resistant PCa clones and use them to treat the corresponding parental cells (22RV1 or DU-145). The results suggested that the exposure to exosomes derived from the DCT resistant cells significantly decreased DCT sensitivity. To assess whether this effect depends on DCTR-miRNAs, both 22Rv1 and DU-145 cells were exposed to exosomes enriched with individual DCTR-miRNAs or to a mixture of exosomes containing each individual DCTR-miRNA. The exposure to the exosomes mixture significantly decreased the sensitivity to DCT in both cell lines, suggesting that exosomal DCTR-miRNAs reduce DCT efficacy probably acting synergistically. In the same way, the exposure of 22Rv1 and DU-145 cells to the conditioned medium derived from PCa cells transfected with a cocktail of the DCTR-miRNAs reduced the DCT sensitivity.
According to our data, we concluded that: a) the DCTR-miRNAs reduce the DCT sensitivity in PCa cells; b) the DCTR-miRNAs modulate the DCT efficacy through the negative regulation of the direct targets TP53INP1 and PPP2CB, mediators of the activity of miR-96-5p and miR-183-5p respectively; c) the DCTR-miRNAs act as extracellular messengers reducing the DCT cytotoxicity in PCa cells exposed to them.