• Zikv

Il virus Zika (ZIKV), appartenente al genere Flavivirus, famiglia Flaviviridae, è un virus a RNA singolo filamento a polarità positiva (ssRNA+), trasmesso tramite puntura di zanzare Aedes aegypti infette o per via sessuale e verticale. Isolato per la prima volta nel 1947 da un primate in Uganda nella Foresta di Zika, ha suscitato poco interesse finché non è stato riscontrato un significativo aumento di neonati microcefalici nati da madre infettate da ZIKV in Brasile e nelle isole del Pacifico. Infatti, mentre la maggior parte degli adulti infettati da ZIKV risulta asintomatica o mostra sintomi lievi, quando infetta la donna nel corso della gravidanza, ZIKV, data la sua capacità di attraversare la barriera placentare e quella ematoencefalica, può portare a malformazioni congenite gravi nel feto, tra cui la microcefalia.
Per questo, è ritenuto urgente lo studio dei meccanismi molecolari alla base della patogenesi di ZIKV. Recentemente, è stato notato che l’infezione fetale da ZIKV ripropone diverse caratteristiche molecolari e anatomiche riscontrate nei disturbi congeniti caratteristici delle sindromi FOXG1, associate ad un fattore di trascrizione la cui mancata regolazione o mutazioni sono state identificate come causa di diverse importanti patologie umane e disturbi dello sviluppo neurologico. È, infatti, un fattore essenziale per lo sviluppo fisiologico del telencefalo e nelle prime fasi della corticogenesi, in quanto svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento del giusto equilibrio tra replicazione cellulare, differenziamento e apoptosi. È stato visto anche che l'infezione da ZIKV delle cellule staminali neurali fetali umane (fNSCs) causa l'inibizione della via Akt-mTOR, una delle vie cellulari chiave essenziali per lo sviluppo del cervello, con conseguente neurogenesi difettosa e attivazione aberrante dell'autofagia. Esaminando le tre proteine strutturali e le sette non strutturali presenti nello ZIKV, è stato descritto che due, NS4A e NS4B, sopprimono in modo cooperativo la via Akt-mTOR e portano alla disregolazione cellulare.
Lo scopo di questa tesi, che si colloca all’interno di uno studio più ampio sull’effetto dell’infezione di ZIKV nella localizzazione subcellulare di FOXG1, è quello di andare ad investigare il ruolo delle proteine non strutturali NS4A e NS4B di ZIKV nella replicazione virale, e nell’induzione dell’effetto citopatico nelle cellule infettate.
Dopo aver messo a punto la produzione di linee cellulari stabili tramite i PLV, sono state trasdotte le cellule A549 e HuH7, scelte in quanto di origine umana (derivanti rispettivamente da polmone e fegato) e permissive per il virus ZIKV, in maniera che sovraesprimessero le proteine NS4A e NS4B di ZIKV.
Come controllo, è stata prodotta un’altra linea cellulare che non esprimesse proteine virali, ma che esprimesse solo la proteina GFP, e che quindi mimasse le cellule wt ma che avesse subito tutte le procedure di trasduzione delle altre linee che invece esprimono NS4A e NS4B.
Innanzitutto, una volta ottenute le linee cellulari che sovraesprimono le proteine NS4A, NS4A-2k-NS4B e GFP, sono state caratterizzate per vedere se differivano in qualche modo dalle wt.
Siamo andati a caratterizzarne la vitalità, la localizzazione delle proteine all’interno delle cellule, la conseguenza della loro presenza sulla produzione di LD e la produzione di INF.
Andando ad investigare ulteriormente, siamo andati a vedere che cosa succedesse una volta infettate le cellule con ZIKV. Differentemente da ciò che ci si potrebbe aspettare, è stato visto un possibile effetto protettivo nelle cellule che esprimono NS4A e NS4A-2k-NS4B; infatti, non è stato riscontrato un effetto citopatico in queste cellule cosa invece presente nelle cellule wt e nella linea che esprime GFP.
È stata messa a punto l’infezione con ZIKV su queste linee cellulari effettuando una successiva resa virale dei surnatanti per vedere se si fosse verificata la produzione di virioni anche in assenza di effetto citopatico.
Il passo successivo di questo lavoro ci ha portato ad indagare se l’effetto protettivo riscontrato in precedenza si manifestasse in corrispondenza di infezione con virus differenti.
L’esperimento effettuato è stato ripetuto scegliendo come virus USUV, un Flavivirus come ZIKV, CHIKV, non facente parte della famiglia dei Flavivirus ma come essi ha un ssRNA+, e per ultimo COX-B5.

Il lavoro è proseguito con la valutazione dell’effetto di NS4A e NS4A-2k-NS4B sull’autofagia, verificando l’espressione dei marcatori autofagici come LC3, mTor e p62 tramite Western Blot.