• Exome Sequencing
• Tumore Midollare della Tiroide

Background
Il tumore midollare della tiroide (MTC), per quanto sia un tumore raro, sta assumendo sempre maggiore importanza clinica, poiché ha presentato negli anni un costante aumento della sua incidenza. Nonostante gli sforzi e i nuovi approcci terapeutici, la mortalità dell’MTC rimane ancora un grave problema clinico, poichè permane elevata a 10 anni, maggiore rispetto a quella dell’istotipo di tumore tiroideo più diffuso (tumore papillare della tiroide). L’unico fattore di rischio ad oggi noto per l’MTC è rappresentato dalle mutazioni del gene RET che è riconosciuto in modo unanime come gene driver del 98% dei casi di MTC familiari e circa del 50% dei casi sporadici. Questa forte esigenza clinica non soddisfatta ha indotto maggiori studi sulla ricerca dei geni driver dei casi familiari e sporadici orfani di mutazioni driver al fine di offrire nuove risorse terapeutiche.

Obiettivi
Scopo di questa tesi è stato quello di identificare l’alterazione genetica driver in una famiglia con carcinoma midollare familiare della tiroide che non presenta alcuna mutazione germinale di RET.

Materiali e metodi
La famiglia studiata era composta da due fratelli affetti dal tumore midollare della tiroide e 18 soggetti non affetti. L’analisi è stata eseguita con tecniche di sequenziamento avanzate (NGS) ed in particolare abbiamo eseguito l’Exome Sequencing (WES) dei due soggetti affetti e due familiari di primo grado non affetti da carcinoma midollare al momento della presente tesi. In base ad una serie di ipotesi di possibile trasmissione genetica e in base alla funzione biologica dei geni identificati, sono state identificate alcune mutazioni di maggior interesse. Le mutazioni risultate di interesse sono state quindi validate mediante analisi di sequenza secondo metodo Sanger nei 4 soggetti e successivamente sono state anche cercate in 16 membri della famiglia apparentemente liberi da malattia.

Risultati
La sequenza dell’esoma (WES) ha portato all’identificazione di 27016 varianti nei 4 soggetti studiati. Al fine di identificare un’alterazione genica rilevante per questa famiglia abbiamo ipotizzato una trasmissione monogenica classica/ad alleli multipli e all’interno di questa tre potenziali modalità di trasmissione del fenotipo: autosomica dominante, autosomica recessiva e X-linked. Sulla base di queste tre ipotesi, abbiamo ristretto l’iniziale rosa di 27016 mutazioni ad una rosa 870 mutazioni per l’ipotesi autosomica dominante, 294 per l’ipotesi autosomica recessiva e 330 per l’ipotesi X-linked. Abbiamo quindi focalizzato la nostra attenzione su mutazioni missense, frameshift e non-frameshift, restringendo ulteriormente la lista delle mutazioni di interesse a 44 mutazioni per l’ipotesi autosomica dominante, 1 per l’ipotesi autosomica recessiva e 2 per l’ipotesi X-linked, per un totale di 47 mutazioni di interesse. A seguito di stime dell’impatto di ciascuna mutazione e della funzione biologica di ciascun gene, sono state identificate 13 mutazioni di maggior interesse a carico di ADGRV1, AFTPH, ANKRD26, BCR, BMP2, CRIM1, CYP2C9, LRP1, PRSS36 (due a suo carico), RFX7, SPTBN1 e USP34. Queste mutazioni sono state validate nei 4 soggetti sottoposti a WES e ricercate negli altri 16 membri della famiglia. A seguito di questo, RFX7 si è rilevato un probabile falso positivo del WES. Le mutazioni di AFTPH, BCR, SPTBN1 e USP34 sono state riscontrate rispettivamente in 6, 9, 7 e 9 membri non affetti. Le mutazioni a carico di ADRGV1, ANKRD26 e LRP1 sono state riscontrate rispettivamente in 3, in 3 e in 5 membri non affetti della famiglia oltre ai due affetti. Le due mutazioni a carico di PRSS36 hanno sempre segregato insieme e sono state riscontrate in 5 membri non affetti. Il gene BMP2, gene della superfamiglia del TGF beta, presenta la stessa mutazione dei due affetti in solo due familiari mentre la mutazione di CRIM1 è stata riscontrata in 4 membri apparentemente liberi da malattia, oltre ai due affetti. Le mutazioni a carico di BMP2, di CRIM1, antagonista funzionale di BMP2, e di STPBN1, regolatore della via del TGF beta, sono presenti in un solo membro non affetto della famiglia. Infine, solo un membro della famiglia presenta la mutazione germinale di CYP2C9 ed, ad oggi, non è affetto dalla malattia.

Conclusioni
Attualmente abbiamo identificato 47 potenziali geni driver del tumore midollare della tiroide. Attualmente, nessuna delle 13 mutazioni di maggior interesse studiate è presente esclusivamente negli affetti, sebbene le mutazioni del complesso genico BMP2-CRIM1-SPTBN1 e del gene CYP2C9 siano presenti, ciascuno di essi, in un solo membro della famiglia attualmente non affetto ma che proprio per questa peculiarità dovrà essere attentamente controllato nel tempo.