• assorbimento intraoculare
• cationi ammonici quaternari
• chitosano
• cornea isolata del coniglio
• desametasone
• gocce oftalmiche
• gruppi tiolici
• mucosa oculare
• occhio del coniglio
• polimeri mucoadesivi
• polimero
• promotori di assorbimento transcorneale

Il trattamento non invasivo della camera anteriore dell’occhio richiede un efficace assorbimento intraoculare del farmaco applicato topicamente. Quindi l’impiego di promotori di assorbimento transcorneale non irritanti e non tossici è molto importante. Nel laboratorio dove ho svolto il mio lavoro di tesi, negli ultimi anni è stata descritta la sintesi, la caratterizzazione e la bioattività di promotori di assorbimento polimerici che hanno la struttura di coniugati ammonio quaternario-chitosano (N+-Ch). Questi coniugati hanno piccole catene pendenti, fatte di n gruppi dietil-dimetilen-ammonici adiacenti, sostituite sul gruppo amminico primario delle unità di ripetizione del chitosano.
Il derivato del chitosano più rappresentativo tra questi era caratterizzato da un grado di sostituzione del 59.2±4.5% (N+(60)-Ch), quindi presentava ancora dei gruppi amminici liberi disponibili per l’attacco covalente sulla catena del chitosano di acido 3-mercaptopropionico attraverso la formazione di legami ammidici. Questo ha portato alla formazione di derivati multifunzionali del chitosano (N+-Ch-SH) con un aumentato potenziale di promuovere l’assorbimento transcorneale dei farmaci. La percentuale di unità di ripetizione del chitosano sostituite con gruppi tiolici era 5% per questo al polimero è stata assegnata la sigla N+(60)-Ch-SH(5). N+(60)-Ch e N+(60)-Ch-SH(5), sono stati testati ex vivo, sulla cornea isolata del coniglio, ed in vivo, nell’occhio del coniglio, per valutare le loro proprietà di aumentare la permeabilità della cornea, di aderire alla mucosa oculare, di promuovere l’assorbimento intraoculare. Il desametasone (DMS) è stato scelto come modello di farmaco lipofilo (logP=1.92) che attraversa l’epitelio per la via transcellulare.
Le gocce oftalmiche contenevano 1% p/v di N+(60)-Ch o di N+(60)-Ch-SH(5) e 0.3% p/v di DMS (ottenuto per spray-drying, diametro particellare < 1.5 µm) in tampone fosfato pH 7.4, 0.0375M (TF) reso isotonico con NaCl. Queste hanno un comportamento reologico newtoniano e la loro viscosità è 5cP e 2.5cP nel caso della sospensione contenente N+(60)-Ch o N+(60)-Ch-SH(5), rispettivamente. L’osmolalità delle gocce variava tra 380 e 394 mOsm/kg. Per gli esperimenti ex vivo su cornea isolata, immediatamente dopo il sacrificio del coniglio le cornee venivano isolate e montate in una cella di perfusione. Il campione da testare era 1 ml di una sospensione di DMS allo 0.3% p/v in tampone ringer (pH 6.8), oppure tale sospensione contenente l’1% p/v di ciascun polimero allo studio. La permeabilità apparente della cornea è stata calcolata secondo la seguente equazione:
Papp = (dM/dt)(1/ACs)
(dM/dt)(1/A), il flusso transcorneale, è la pendenza del grafico della massa permeata per unità di superficie rispetto al tempo; Cs rappresenta la solubilità del DMS nella fase donatrice in assenza di polimero (0.12 mg/ml).
I dati sulla permeazione di DMS attraverso la cornea isolata di coniglio indicano che entrambi i polimeri aumentano la permeabilità apparente di DMS e che non c’è differenza significativa tra di loro (N+(60)-Ch, Papp 7.11±0.61 cm sec-1, N+(60)-Ch-SH(5), Papp 6.61±0.39 cm sec-1 ). Tale effetto si pensa sia dovuto alla capacità dei cationi ammonici quaternari presenti su entrambi i polimeri di perturbare l’ordine del doppio strato lipidico della membrana delle cellule corneali. Dal momento che il valore di lag time è significativamente minore nel caso di N+(60)-Ch-SH(5), il trasporto cumulativo di DMS dopo l’intera durata dell’esperimento è significativamente più alto. Dunque N+(60)-Ch-SH(5) ha mostrato il miglior potenziale come promotore di assorbimento intraoculare di DMS perché produce un effetto più rapido. Questo è particolarmente importante se si considera che le gocce oftalmiche non viscose sono caratterizzate da un tempo di contatto molto breve.
Le gocce sono state confrontate per il tempo di residenza medio del DMS nel fluido lacrimale dei conigli (MRT). Per ciascuna soluzione polimerica sono state ottenute 8 curve di eliminazione di DMS dal fluido lacrimale, ciascuna determinata in un singolo occhio di animali differenti. Per ciascuna curva è stato calcolato un valore di MRT come rapporto AUMC/AUC (area under momentum curve/area under curve). I dati ottenuti mostrano che entrambi i polimeri fanno aumentare enormemente l’MRT che passa da 5.07±0.25 min nel caso del controllo a 65.74±4.91 min nel caso di N+(60)-Ch, fino ad arrivare a 77.96±3.57 min nel caso di N+(60)-Ch-SH(5). Le ipotesi che possono spiegare tali risultati sono: 1) entrambi i polimeri sono mucoadesivi per l’interazione dei loro cationi ammonici quaternari con gli anioni delle glicoproteine del muco; 2) la presenza di gruppi tiolici fa aumentare la mucoadesività del polimero grazie alla formazione di ponti disolfuro con le glicoproteine del muco che ancorano il polimero alla superficie corneale.
Gli esperimenti di permeazione ex vivo hanno evidenziato effetti di aumento della permeabilità corneale da parte dei derivati del chitosano. Tali effetti tuttavia sono insufficienti di per sé ad anticipare l’effettiva promozione dell’assorbimento transcorneale in vivo, perché questi polimeri richiedono un certo di tempo per esercitare la loro azione ed il tempo di contatto che si ottiene con le gocce oftalmiche è piuttosto breve. Quindi è stata misurata la farmacocinetica nell’umore acqueo del coniglio per verificare l’efficacia dei polimeri come promotori di assorbimento e la loro tollerabilità oculare. I dati di AUCrel (area sotto la curva concentrazione nell’umore acqueo vs tempo relativa, data dal rapporto tra l’AUC ottenuta dopo somministrazione delle gocce contenenti ciascun polimero e quella ottenuta con le gocce di controllo) mostrano che in presenza dei polimeri l’assorbimento intraoculare di DMS è significativamente maggiore rispetto al controllo e che il polimero multifunzionale N+(60)-Ch-SH(5) è significativamente più efficace del polimero non tiolato N+(60)-Ch (AUCrel 5.31 contro 3.44, rispettivamente). Per spiegare tali risultati si ammette che la mucoadesività dei polimeri, prolungando il tempo di contatto, permetta loro di esercitare l’effetto di permeabilizzazione. La maggiore mucoadesività di N+(60)-Ch-SH(5), dovuta ai gruppi tiolici, si riflette in una maggiore promozione dell’assorbimento intraoculare. In conclusione, i gruppi ammonici quaternari sono responsabili sia della permeabilizzazione che della mucoadesione, mentre i gruppi tiolici aumentano la mucoadesione. Questo effetto sinergico è alla base della bioattività del polimero. Gli esperimenti in vivo hanno inoltre indicato una buona tollerabilità oculare di questi derivati del chitosano.