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La Wastewater-Based Epidemiology (WBE) è uno strumento epidemiologico basato sull’analisi delle acque reflue. Il suo scopo è quello di rilevare specifici biomarcatori connessi alla salute della popolazione servita dall’impianto di trattamento delle acque reflue in analisi. Se un agente virale è escreto nelle urine e/o nelle feci dei soggetti infetti, la WBE può essere utilizzata per monitorarne la presenza e la quantità all’interno delle acque di scarico.
La WBE può quindi avere un’utilità sia durante le epidemie, che per la sorveglianza di virus endemici. In particolare, nel primo caso, dato che SARS-CoV-2 ed il suo genoma sono presenti nelle feci di pazienti affetti da COVID-19 (sintomatici e asintomatici), è stato possibile rilevarne il materiale genetico nei reflui di diversi paesi del mondo. Nello specifico, alcuni studi provano come l’aumento della concentrazione di SARS-CoV-2 nei reflui possa precedere di alcuni giorni l’aumento dei casi clinici, ponendo le basi per allestire sistemi di allerta precoce basati sulla sorveglianza ambientale che aiutino a limitare la circolazione del virus. Altri agenti virali come adenovirus, norovirus ed enterovirus infettano le cellule del tratto gastrointestinale e sono tra i principali agenti eziologici di gastroenteriti acute di origine virale. Per questo, sono normalmente presenti nei reflui e rappresentano obiettivi ideali per il monitoraggio di patogeni endemici tramite WBE.

Lo scopo di questa tesi è stato quello di monitorare la concentrazione di SARS-CoV-2 in campioni di reflui urbani di quattro depuratori della regione Toscana e approfondirne la connessione con i dati clinici. Inoltre, gli stessi campioni sono stati testati per la presenza di adenovirus, norovirus GII ed enterovirus non-polio, con l’obiettivo di ottenere dati riguardanti la loro distribuzione temporale e spaziale.

I prelievi sono stati effettuati all’ingresso degli impianti, con cadenza settimanale per il monitoraggio di SARS-CoV-2 e mensile per il monitoraggio di adenovirus, norovirus ed enterovirus.
In laboratorio, i campioni sono stati inattivati a 56°C per 30 minuti e concentrati tramite precipitazione mediante PEG/NaCl. L’estrazione degli acidi nucleici (DNA e RNA) è stata effettuata utilizzando un kit a base di silice magnetica e gli inibitori di PCR sono stati rimossi tramite procedure di purificazione. La determinazione quantitativa del genoma virale è svolta mediante real-time (RT-)qPCR, attraverso la quale è stato possibile quantificare il numero di copie genomiche presenti in 1 litro di refluo (CG/l).
Successivamente, i dati molecolari sono stati normalizzati in base alla portata giornaliera del depuratore e una stima del numero di abitanti serviti dal sistema fognario, in riferimento ad un’unità di popolazione di 10000 abitanti (CG/gg/ab).
I dati clinici sui nuovi casi settimanali di COVID-19 nei Comuni serviti dai depuratori sono stati ottenuti dai comunicati delle ASL competenti, disponibili fino a maggio 2022.

Da ottobre 2021 a luglio 2022, 90 campioni su 166 (54%) sono risultati positivi per SARS-CoV-2, con una media geometrica ( deviazione standard geometrica) di concentrazione di genoma virale pari a 3,24 ·108  0,51 CG/gg/ab. Nel periodo ottobre 2021-maggio 2022, la concentrazione di SARS-CoV-2 nelle acque reflue e il numero dei casi clinici settimanali sono risultati correlati positivamente in maniera significativa (Pearson, Pvalue≤0,05).
Da ottobre 2021 a luglio 2022, su 40 campioni analizzati per la presenza di virus enterici, 31 sono risultati positivi per adenovirus (77,5%), 30 per norovirus (75%) e 15 per enterovirus (37,5%), con una media geometrica ( deviazione standard geometrica) di concentrazione di genoma virale, rispettivamente, pari a 2,44 ·109  0,91 CG/gg/ab, 7,53 ·108  0,58 CG/gg/ab e 6,18 ·107  0,52 CG/gg/ab. Per lo stesso periodo di tempo, l’influenza del mese di campionamento è risultata significativa per la concentrazione del genoma dei tre i virus enterici, mentre l’influenza luogo di campionamento è risultata significativa per la concentrazione del genoma di adenovirus (Anova, Pvalue≤0,05).

I dati raccolti mostrano come la WBE permetta di ottenere informazioni sulla distribuzione virale nei reflui monitorati e, di conseguenza, sulla loro diffusione nella popolazione di riferimento. Inoltre, rispetto ai dati di natura clinica, il monitoraggio ambientale non risente dei bias connessi alla sintomatologia del paziente, poiché le misurazioni si riferiscono all’intera comunità. Per questo, la WBE è un approccio analitico potenzialmente utile per lo studio degli agenti virali alla base di molte malattie infettive, sia in scenari di emergenza, come la pandemia causata da SARS-CoV-2, che nel contesto di virus comunemente circolanti.