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L’asma bronchiale è una malattia cronica, solitamente su base infiammatoria, caratterizzata da ostruzione bronchiale di norma reversibile e da iperreattività bronchiale. Essa presenta un’alta prevalenza nel mondo con circa 300 milioni di individui affetti.
E’ caratterizzata da sintomi respiratori in genere variabili come intensità e frequenza di presentazione: sibili, tosse e senso di costrizione toracica, associata a ampia variabilità consensuale del calibro bronchiale.
Negli ultimi anni si è consolidata una nuova visione della malattia in cui si enfatizza il suo carattere eterogeneo potendo infatti configurarsi con pattern clinici, biologici e funzionali estremamente diversi. L’estrema eterogeneità dell’asma ha permesso quindi di individuare differenti fenotipi ed endotipi di malattia, in cui ad un determinato meccanismo patogenetico corrisponde un quadro biologico e conseguenti manifestazioni cliniche. La caratterizzazione dell’endotipo di malattia riconosce principalmente due meccanismi alla base del processo infiammatorio: l’attivazione della cascata infiammatoria Th2, implicata nella patogenesi allergica, la cui attivazione porterà alla liberazione di citochine pro-infiammatorie specifiche ed il cui mediatore finale del processo infiammatorio sarà il granulocita eosinofilo; ed il meccanismo TH1 mediato, che riconosce in genere fattori inducenti differenti (inquinanti, fumo, virus etc) e che si configura con una diversa attivazione del pattern citochinico; con il granulocita neutrofilo come effettore ultimo.
Nel tempo sono state formulate differenti definizioni di asma grave; attualmente, quella che meglio risponde alle esigenze di gestione del paziente asmatico è una definizione operativa in cui si definisce grave l’asma che per essere controllato abbia richiesto negli ultimi 12 mesi terapie inalatorie massimali (step 4 o 5 secondo le linee guida GINA: alte dosi di corticosteroidi inalatori associate a β2 agonisti a lunga durata o antileucotrienici o teofillina), o terapie con corticosteroidi sistemici per più di sei mesi, oppure quadri asmatici che rimangono “non controllati” nonostante queste terapie.

RIMODELLAMENTO
Il rimodellamento delle vie aeree è ritenuto il meccanismo alla base della cronicizzazione e progressione dell’asma. Esso è caratterizzato da alterazioni strutturali sia a livello delle grandi che delle piccole vie aeree, e consiste nell’aberrante riparazione dell’epitelio e nell’accumulo di miofibroblasti che contribuiscono alla deposizione di proteine della matrice extra-cellulare ed in ultima analisi allo sviluppo di un’ostruzione bronchiale persistente.
Sono numerose le cellule ed i mediatori implicati in questi processi: L’IL-13 è implicata nell’aumentata secrezione di muco e di TGF-ß. Le chemochine eotassina, RANTES, MCP-3 e MCP-4 agiscono nel reclutamento degli eosinofili. I macrofagi sintetizzano e secernono l’attivatore del plasminogeno, metalloproteasi e fattori di crescita, come PDGF, FGF e TGF-ß. I neutrofili secernono l’Elastasi neutrofila che innesca la secrezione di TGF-β e Metalloproteinasi-9. Gli eosinofili sintetizzano la proteina cationica eosinofila, proteina basica maggiore, neurotossina, perossidasi, ROS, chemochine e leucotrieni agendo sia direttamente tramite danno tissutale, sia indirettamente stimolando i processi riparativi. I mastociti producono IL-4, IL-13, agiscono su fibroblasti, miofibroblasti, cellule muscolari lisce producendo e secernendo TGF-β, PDGF, Amfiregulina, chimasi e triptasi.
Le alterazioni strutturali principali nel rimodellamento sono rappresentate dalla fibrosi sub-epiteliale, aumento di massa del muscolo liscio bronchiale ed angiogenesi. La fibrosi subepiteliale interessa la lamina reticolare collocata profondamente alla membrana basale comportando un ispessimento di quest’ultima per deposizione di collagene di tipo I, III e V. Il processo sembra essere conseguenza, in parte, di uno squilibrio tra deposizione e degradazione di matrice extracellulare da parte dei fibroblasti, in favore della deposizione. Le principali cellule coinvolte nella fibrosi sub-epiteliale sono i miofibroblasti, cellule in grado sia di acquisire capacità contrattili migrando nello strato sub-epiteliale sia di rilasciare citochine pro-infiammatorie, chemochine e proteine della matrice extra-cellulare. Sono stati descritti numerosi mediatori presenti nelle vie aeree di soggetti asmatici che potrebbero essere implicati nella differenziazione dei fibroblasti in miofibroblasti. Il più studiato è il Trasforming Growth Factor Beta 1 o TGF-ß, una potente citochina prodotta sia da cellule infiammatorie sia da cellule epiteliali, endoteliali, muscolari lisce e fibroblasti. Esso regola la funzionalità fibroblastica e miofibroblastica e modula la produzione di numerose proteine della matrice extracellulare come collagene, proteoglicani e tenascina. L’azione di questo mediatore è direttamente implicata nel fenomeno del rimodellamento, il suo incremento infatti correla con il numero di fibroblasti e l’ispessimento della membrana basale. Assieme ad altri mediatori come EGF epidermal growth factor, FGF-2 fibroblast growth factor-2, IGF-1 insulin like growth factor-1, PDGF plateled-derived growth factor ed endotelina-1 possiede un ruolo cardine nel determinare la transizione epitelio-mesenchimale. Esso guida la differenziazione dei fibroblasti in miofibroblasti stimolando inoltre la produzione e la secrezione di metalloproteinasi-9, una proteasi con attività collagenolitica. Un’ulteriore metalloproteasi implicata nel fenomeno del rimodellamento è ADAM33, i cui meccanismi biologici sono ancora sconosciuti; è stato ipotizzato che partecipi attivamente al rimodellamento poiché risulta espressa su fibroblasti, miofibroblasti e cellule muscolari lisce delle vie aeree.
Tra i nuovi marker di fibrosi subepiteliale è presente la periostina, espressa in una notevole varità di tessuti sia embrionali che adulti e ad elevate concentrazioni in corso di carcinogenesi. Essa aumenta in corso di infiammazione eosinofilica, è implicata in condizioni di atopia come rinite e rino-sinusite, ed è coivolta direttamente nel rimodellamento delle vie aeree: stimolata dall’IL-4 e dall’IL-13 ma indipendentemente dall’azione di TGFß viene secreta dai fibroblasti bronchiali costituendo una struttura a forma di reticolo insieme a fibronectina, tenascina e collagene di tipo IV concorrendo alla fibrosi subepiteliale, promuove la differenziazione dei fibroblasti in miofibroblasti e la loro successiva migrazione ed inoltre, in sinergia con il TGF-Beta, stimola la produzione di proteine della matrice extracellulare e la differenziazione dei miofibroblasti.
L’incremento della massa muscolare liscia delle vie aeree è stato ampiamente dimostrato nei soggetti asmatici ed è strettamente associato all’iperreattività bronchiale. Nei soggetti asmatici la distanza tra l’epitelio respiratorio e lo strato muscolare è ridotta e questo potrebbe determinare un più precoce raggiungimento delle cellule muscolari lisce da parte di stimoli broncocostrittori presenti nel lume rispetto ai soggetti sani. L’alterazione a livello della muscolatura liscia rappresenterebbe il cambiamento strutturale fondamentale che distingue le forme di asma grave dalle moderate potendo inoltre contribuire alla difficoltà di ottenere un livello di controllo di malattia adeguato in alcuni soggetti affetti. L’FGF-2 fibroblast growth factor-2 è il principale determinante dell’iperplasia delle cellule della muscolatura liscia.
Numerosi studi hanno dimostrato come l’angiogenesi ed il rimodellamento microvascolare delle vie aeree siano processi caratterizzanti l’asma cronico. L’aumento del numero e della dimensione dei vasi non si limita solamente a soggetti con asma grave ma interessa anche i pazienti con malattia lieve. L’ipotesi è che nell’asma si determini uno squilibrio tra fattori pro-angiogenetici ed anti-angiogenetici: nell’espettorato di soggetti asmatici è stato riscontrato un aumentato rapporto tra VEGF vascular endothelial growth factor, uno dei principali fattori pro-angiogenetici ed endostatina, fattore anti-angiogenetico. Inoltre è stato dimostrata l’azione diretta di VEGF nella risposta allergica in soggetti asmatici: essa possiede un ruolo nella risposta infiammatoria antigene-indotta Th2 mediata da IL-13, con incremento della produzione di muco, deposizione di collagene ed iperplasia delle cellule muscolare lisce assieme a prevedibili alterazioni a livello dell’angiogenesi come edema e rimodellamento vascolare. VEGF inoltre è in grado di determinare un’amplificazione della risposta Th2 mediata ed i suoi livelli sono correlati con quelli della metalloproteasi-9.
SCOPO DELLA TESI
Nell’ipotesi che la persistente ostruzione al flusso aereo si associ ad un maggior grado di rimodellamento, ci siamo posti come scopo quello di verificare se alcuni dei biomarker oggi disponibili siano in grado di identificare un pattern di rimodellamento in una popolazione di soggetti con asma grave. In particolare la nostra attenzione si è focalizzata sulla periostina, che è stata riconosciuta in tempi recenti non solo come un marker di infiammazione eosinofilica ma anche come co-reponsabile della fibrosi sub-epiteliale, e su TGF-ß, il cui ruolo cardine nello sviluppo del rimodellamento delle vie aeree è ampiamente riconosciuto in letteratura.
A tale scopo abbiamo condotto uno studio pilota, selezionando dalla nostra casistica di pazienti con asma grave un sottogruppo che ha sviluppato nel tempo ostruzione bronchiale non più completamente reversibile, ed un altro con normale funzione polmonare nei periodi di stabilità. In questi due sottogruppi di pazienti abbiamo analizzato vari mediatori correlati al processo di rimodellamento, oltre ad indicatori del tipo e grado di infiammazione bronchiale, utilizzando il materiale biologico dell’espettorato indotto come materiale indicativo del processo infiammatorio presente nelle vie aeree.
Questi dati, assieme alle usuali valutazioni cliniche e strumentali, potrebbero dare indicazione su quali potenziali fattori di rimodellamento incentrare la nostra attenzione per studi su casistiche più numerose.
PROTOCOLLO DI STUDIO
Hanno preso parte allo studio 45 soggetti con asma, con età media di 60.3 anni (range 25-80). 42 pazienti erano non fumatori, solo 3 pazienti ex fumatori con pack years<10. Il BMI (body mass index) presentava una media di 28.01 indicando come mediamente i pazienti reclutati fossero in sovrappeso. Il 66% di essi presentavano Atopia ed il 27% reazione di ipersensibilità ad ASA e/FANS. Per quanto riguarda l’insorgenza di malattia la media di età risultava essere 39 anni e ben il 60% presentava un’insorgenza tardiva (late onset). La durata media di malattia risultava essere di 21.3 anni. Nel momento in cui i pazienti sono stati reclutati per lo studio il 42% di essi riferiva buon controllo della patologia, quelli con parziale controllo di malattia erano il 49% mentre solo il 9% risultava non controllato. La valutazione del controllo è stata fatta tenendo in considerazione la presenza di sintomi diurni e necessità di broncodilatatore al bisogno più di due volte a settimana, risvegli notturni dovuti ad asma e limitazione delle attività causata dalla malattia nelle 4 settimane precedenti alla visita. Tutti i pazienti stavano effettuando una terapia regolare con combinazione di broncodilatatore e steroide inalatorio a dosaggio medio-alto, in particolare il 62% attuava una terapia GINA STEP 4 mentre il restante 38% GINA STEP 5. Il pattern infiammatorio prevalente è risultato essere quello eosinofilico presente nel 45% sei soggetti analizzati.
I biomarcatori studiati e misurati nei liquidi biologi sono stati: la periostina, transforming growth factor beta (TGF-ß), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), fibroblast growth factor-2 (FGF-2), interleuchina-8 (IL-8) e RANTES.
RISULTATI
I pazienti sono stati suddivisi in due gruppi sulla base dei valori ottenuti all’esame spirometrico. In particolare:
- Gruppo dei pazienti con ostruzione bronchiale persistente: essi presentavano all’esame spirometrico un indice di Tiffenau ≤88 %pred nei soggetti di sesso maschile o ≤89 %pred nei soggetti di sesso femminile (media: 71.9). In questi soggetti il valore medio di FEV1 in % del teorico era 63.9%, raggiungendo una media di 70.5% dopo l’utilizzo di broncodilatatore, denotando pertanto una ostruzione di medio-lieve entità.
- Gruppo dei pazienti senza ostruzione bronchiale: gruppo di controllo con Indice di Tiffena ≥ 88 %pred nei soggetti di sesso maschile ed 89 %pred nei soggetti di sesso femminile e variabilità dei valori di FEV1 in % del predetto nella storia clinica, con normale funzione polmonare nei periodi di stabilità.
Per quanto riguarda i dati clinico-demografici, i due gruppi non presentano differenze statisticamente significative, anche se è opportuno sottolineare come le femmine siano l’83% nel gruppo dei pazienti non ostruiti contro il 59% nel gruppo degli ostruiti.
Per quanto concerne i marcatori biologici, sono presenti alcune differenze statisticamente significative o ai limiti della significatiità. In particolare i valori di TGF-ß e periostina risultano essere più elevati nell’espettorato dei pazienti con ostruzione persistente, con una significatività rispettivamente inferiore a 0.01 e 0.05. Inoltre quest’ultima nell’espettorato indotto si è dimostrata correlare in maniera inversa sia con i valori di FEV1 pre broncodilatore in % del teorico che con i valori di FVC post broncodilatatore in % del teorico.
GMCSF e FGF2 risultano invece statisticamente più elevati nel gruppo dei pazienti senza ostruzione persistente con una significatività rispettivamente inferiore a 0.05 e 0.001.
Per quanto riguarda la periostina nel siero, essa mostra valori ai limiti della significatività (p=0.06) sempre a favore del gruppo degli ostruiti.
Successivamente, dopo aver ottenuto queste indicazioni sui valori di periostina nell’espettorato e nel sangue abbiamo calcolato la mediana dei suoi valori in questi due liquidi biologici, dividendo i 45 pazienti dello studio in un gruppo che presentava valori maggiori rispetto alla mediana ed un altro con valori inferiori.
Per quanto riguarda la periostina nell’espettorato, nei due gruppi è presente una differenza ai limiti della significativa (p=0.05) nella % di eosinofili presenti nell’espettorato, con i soggetti con valori di periostina nell’espettorato superiori alla mediana che mostrano valori più elevati di eosinofili nell’espettorato. Inoltre il gruppo con valori di periostina nell’espettorato maggiore della mediana presenta una percentuale di pazienti con ostruzione persistente del 67% contro il 42% di quelli con Periostina minore della mediana. Questi ultimi risultano avere un miglior controllo di malattia, mentre i pazienti che alla visita riferivano assenza di controllo di malattia (22%) appartenevano solo al gruppo con periostina nell’espettorato maggiore della mediana.
La distinzione sulla base dei valori di periostina nel sangue ha evidenziato una differenza significativa (p<0.05) nell’età media dei pazienti: in particolare l’età è risultata più elevata (65 anni) nei pazienti con valori più alti di periostina ematica rispetto a quelli con valori minori (55 anni). Inoltre i pazienti con valori di periostina nel sangue maggiore della mediana mostravano una tendenza (p=0.05) per quanto riguarda la percentuale di pazienti con ostruzione persistente; questi sono il 68%, a differenza del 37% nel gruppo di pazienti con valori di periostina nel sangue minore della mediana.

DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Lo studio è risultato positivo per differenze statisticamente significative nei due gruppi (persistente ostruzione bronchiale vs assente ostruzione) per i mediatori pro-fibrogenici periostina, TGF-Beta, come pure per altri due mediatori (GM-CSF ed FGF-2) misurati nell’espettorato indotto.
Periostina e TGF-ß sono risultati più elevati nei soggetti ostruiti in concordanza con gli studi di letteratura che riconoscono il ruolo di entrambi i mediatori nello sviluppo del processo di rimodellamento delle vie aeree: la periostina promuove la differenziazione dei fibroblasti in miofibroblati, la loro migrazione e stimola la produzione delle proteine della matrice extra-cellulare come co-fattore del TGF-ß. Quest’ultimo guida la differenziazione dei fibroblasti in miofibroblasti, modula la produzione di numerose proteine della matrice extracellulare e possiede un ruolo cardine nel determinare la transizione epitelio-mesenchimale.

Per quanto concerne GM-CSF ed FGF-2 essi sono risultati più elevati nei soggetti non ostruiti. I maggiori livelli di fattore di crescita stimolante le colonie granulocito-macrofagiche nell’espettorato di soggetti con asma grave che non hanno sviluppato rimodellamento, risulta in linea con la presenza di un maggior grado di infiammazione di tipo eosinofilico presente in questi soggetti, da momento che esso viene secreto dai linfociti T e dagli eosinofili stessi ed è fondamentale per il reclutamento e la sopravvivenza di questi granulociti nei tessuti periferici. I risultati ottenuti dal dosaggio del fattore di crescita fibroblastico-2 non sono chiaramente spiegabili e suggeriscono per questo mediatore un ruolo differente, da quello pro-fibrotico dimostrato in vitro, come ad esempio quello protettivo in seguito a lesioni epiteliali polmonari evidenziato in un recente studio effettuato sui topi.

Inoltre, i soggetti con livelli di periostina nell’espettorato più elevati hanno presentato anche valori percentuali di eosinofili nell’espettorato maggiori rispetto ai pazienti che presentavano valori di questo biomarcatore inferiori rispetto alla mediana ottenuta, confermando i dati presenti in letteratura che dimostrano come la produzione di questa proteina aumenti in corso di infiammazione eosinofilica.

In conclusione, questo studio pilota ha permesso di individuare alcuni biomarcatori (la periostina e il TGF-beta) che risultano più elevati nel supernatante dell’espettorato di soggetti con asma grave che avevano sviluppato ostruzione bronchiale non più completamente reversibile rispettto a quelli con normale funzione respiratoria. Considerando il ruolo che questi due mediatori hanno in modelli sperimentali di rimodellamento, questa osservazione ne conferma l’importanza come biomarcatori dello sviluppo di ostruzione bronchiale non più completamente reversibile nei pazienti con asma grave. Questo aspetto viene confermato dall’esame della periostina nel sangue, anche se in questo liquido biologico il segnale è meno evidente, suggerendo quindi che il materiale ricavato dall’espettorato indotto sia un campione più adeguato per lo studio dei processi che si svolgono nelle vie aeree.
Il maggior livello di GM-CSF nell’espettorato di soggetti con asma grave che non hanno sviluppato rimodellamento è in linea con un maggior grado di infiammazione di tipo eosinofilico presente in questi soggetti, mentre il maggior livello di FGF-2 sempre in questi soggetti non è chiaramente spiegabile e suggerisce ruoli diversi da quello pro-fibrotico di questo mediatore.
Infine, la presenza di un maggior livello di eosinofilia nell’espettorato dei soggetti con valori di periostina nell’espettorato superiore alla mediana suggeriscono che in effetti il processo infiammatorio e quello di rimodellamento (di cui la periostina può essere un indicatore) possano procedere in maniera parallela, secondo le più moderne vedute relative alla fisiopatologia del rimodellamento nell’asma.