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Thesis etd-08272021-164952


Thesis type
Tesi di specializzazione (4 anni)
Author
MACEROLA, ELISABETTA
URN
etd-08272021-164952
Thesis title
Analisi di trascritti di fusione in tumori tiroidei
Department
MEDICINA CLINICA E SPERIMENTALE
Course of study
PATOLOGIA CLINICA E BIOCHIMICA CLINICA (non medici)
Supervisors
relatore Prof. Basolo, Fulvio
Keywords
  • riarrangiamenti genici
  • tumori tiroidei
  • patologia molecolare
  • trascritti di fusione
Graduation session start date
20/09/2021
Availability
Withheld
Release date
20/09/2061
Summary
L'analisi di riarrangiamenti genici di interesse clinico nei tumori solidi presenta diverse problematiche dal punto di vista tecnico, soprattutto se occorre analizzare molteplici marcatori su materiale biologico quantitativamente e qualitativamente scarso. Le tecniche a disposizione del laboratorio di patologia molecolare sono molteplici, ciascuna con peculiari vantaggi e svantaggi.
I riarrangiamenti genici che si ritrovano più frequentemente nei tumori tiroidei coinvolgono i geni ALK, BRAF, NTRK1, NTRK3, PPARG, RET e THADA; l'analisi di tali marcatori è utile a scopo diagnostico, prognostico e predittivo di risposta a terapie farmacologiche. La recente approvazione di inibitori selettivi diretti contro recettori tirosin chinasici coinvolti in eventi di fusione genica ha accelerato la necessità di sviluppare tecniche efficienti per l’analisi dei riarrangiamenti genici nei tumori solidi, inclusi i tumori della tiroide.
Lo scopo del lavoro è stato quello di valutare la presenza di fusioni geniche su una serie di tumori tiroidei utilizzando una metodologia multi-target basata sull'ibridazione diretta delle molecole di RNA con sonde marcate, e sulla successiva conta digitale dei complessi così formati (piattaforma nCounter, nanoString Technologies).
Un pannello contenente 29 sonde specifiche per la sequenza dei punti di fusione e 53 sonde per la valutazione dello sbilanciamento nell'espressione delle regioni 3' e 5' dei geni coinvolti è stato appositamente disegnato per il rilevamento di trascritti di fusione a carico dei geni ALK, BRAF, NTRK1, NTRK3, PPARG, RET e THADA. L'analisi è stata condotta sull'RNA estratto da 88 campioni di tessuto fissato in formalina ed incluso in paraffina relativi a carcinomi papillari della tiroide di pazienti pediatrici. I risultati sono stati sottoposti a conferma con altre tecniche d'analisi molecolare, ovvero FISH (fluorescent in situ hybridization), PCR retro-trascrizionale (RT-PCR) e sequenziamento di nuova generazione (NGS).
Tutti i campioni analizzati con la metodica nCounter sono risultati idonei all'analisi. Sono stati rilevati 48 eventi di fusione a carico dei geni ALK (n=6), NTRK1 (n=5), NTRK3 (n=18), PPARG (n=2) e RET (n=17). L'utilizzo di tecniche alternative ha confermato la presenza di riarrangiamenti in 46 dei 48 campioni risultati positivi con l'analisi nCouter. All'analisi NGS è stato possibile ottenere un risultato per soli 5 dei 15 campioni analizzati, probabilmente a causa dell'elevato grado di frammentazione dell'RNA.
La tecnica nCounter ha consentito di ottenere un risultato in tutti i campioni analizzati, nonostante la qualità dell’RNA non fosse ottimale; inoltre sono stati rilevati 48 riarrangiamenti genici, di cui 46 confermati con altre tecniche d’analisi. Pertanto, anche se sarà necessaria un’ulteriore ottimizzazione del pannello di geni, la metodica rappresenta un valido strumento per il rilevamento dei trascritti di fusione nei tumori tiroidei.
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