• stress ossidativo
• Sclerosi Laterale Amiotrofica
• PGC-1alpha
• esercizio fisico

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata da paralisi muscolare progressiva che riflette la degenerazione dei motoneuroni della corteccia motoria primaria, del tronco cerebrale e del midollo spinale.
Sebbene l’eziopatogenesi della malattia rimanga ancora sconosciuta, nel corso degli anni sono stati proposti numerosi meccanismi di morte neuronale tra i quali i più accreditati sono l’eccitotossicità glutammatergica, lo stress ossidativo, le disfunzioni mitocondriali e la presenza di inclusioni citoplasmatiche costituite da aggregati di proteine. Nonostante il coinvolgimento dello stress ossidativo nella SLA sia stato ampiamente studiato, non è ancora noto il preciso meccanismo molecolare alla base della risposta cellulare all’insulto ossidativo.
Le Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS), prodotte principalmente a livello mitocondriale, in condizioni fisiologiche, sono neutralizzate dai meccanismi di difesa antiossidante; quando tale equilibrio viene alterato, si ha un incremento della produzione delle ROS e si instaura una condizione di stress ossidativo. L’incremento delle ROS media molte funzioni biologiche, tra cui l’attivazione di un co-attivatore trascrizionale tessuto-specifico, il Peroxisome Proliferator- Activated Receptor Gamma Coactivator 1 alpha (Pgc-1α) che gioca un ruolo importante nella regolazione della biogenesi mitocondriale e dei meccanismi di difesa antiossidante. PGC-1α è maggiormente espresso nei tessuti con alto metabolismo, come il muscolo scheletrico e l’encefalo. È stato osservato che il polimorfismo (SNP) 1444 G>A (Gly482Ser) nell’esone 8 del gene PGC-1α induce un cambiamento nella struttura della proteina che provoca, a sua volta, una riduzione dei livelli nonché dell’attività trascrizionale della proteina stessa. Studi condotti su atleti hanno messo in evidenza che l’allele wild-type G è associato ad una maggiore resistenza fisica, rispetto agli individui con genotipo omozigote AA (Ser482Ser).
Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare se lo SNP 1444 G>A costituisse un fattore di rischio per l’insorgenza della forma sporadica di SLA (sSLA) e le sue possibili implicazioni nella risposta cellulare all’insulto ossidativo in condizioni di riposo e durante un esercizio fisico. Sono stati pertanto valutati:
a) la distribuzione delle frequenze alleliche e genotipiche (SNP 1444 G>A nel gene PGC-1α) in 197 pazienti con sSLA e 197 controlli sani. La genotipizzazione è stata condotta mediante analisi Restriction fragment length polymorphism (RFLP) e, per conferma, tramite sequenziamento diretto della regione del DNA di interesse;
b) i livelli plasmatici di alcuni biomarcatori di stress ossidativo in un sottogruppo di 74 pazienti con sSLA e in 65 controlli sani; in particolare sono stati dosati, come marker di danno ossidativo i Prodotti di Ossidazione Avanzata alle Proteine (AOPP) e, come markers antiossidanti non enzimatici, la Capacità Antiossidante Ferro Riducente (FRAP) e i gruppi tiolici totali plasmatici. Inoltre, in 35 pazienti sono state valutate l’attività totale dell’enzima Superossido Dismutasi (Sod) e della Catalasi (Cat), quali markers antiossidanti enzimatici, mediante metodo colorimetrico e analisi spettrofotometrica;
c) eventuali variazioni nei livelli plasmatici dei biomarcatori analizzati tra pazienti con sSLA omozigoti wild-type GG e portatori della variante allelica rara 1444A (A Carriers);
d) possibili variazioni dei livelli plasmatici di biomarcatori di stress ossidativo (AOPP, FRAP, tioli e acido lattico) in un sottogruppo di 28 pazienti sSLA sottoposti ad un test da sforzo incrementale ai muscoli dell’avambraccio: le valutazioni sono state condotte a diversi steps: prima (basale), durante (30%, 50% e 70% della Contrazione Volontaria Massimale, CVM) e dopo 15 minuti dalla fine dello sforzo (recupero);
e) l’eventuale influenza della variante allelica rara A sui livelli dei biomarcatori di stress ossidativo, valutati durante il protocollo di esercizio fisico.
L’analisi dei dati relativi allo SNP 1444 G>A nel gene PGC-1α non mostra differenze statisticamente significative nella distribuzione genotipica e nelle frequenze alleliche dei pazienti con sSLA rispetto ai relativi controlli.
Analizzando i risultati relativi allo stress ossidativo, si osserva che i livelli plasmatici basali degli AOPP (p<0.001) risultano essere più elevati nei pazienti sSLA rispetto ai controlli, mentre i livelli della FRAP (p<0.001) e dei tioli (p<0.001) sono ridotti nei primi rispetto ai secondi. Inoltre, prendendo in esame rispettivamente la popolazione totale studiata, il gruppo dei pazienti e il gruppo dei controlli, i livelli dei suddetti biomarcatori di stress ossidativo non differiscono tra soggetti wild-type e A Carriers. Anche dalla valutazione dei livelli degli antiossidanti enzimatici (Sod e Cat) nel sottogruppo di pazienti, esaminati solo per questi due biomarcatori, non si osservano differenze tra portatori e non portatori della variante allelica rara A (482Ser).
I livelli plasmatici medi degli AOPP, della FRAP e dei tioli misurati prima, durante e dopo lo sforzo fisico, non mostrano variazioni significative, mentre si riscontrano differenze nei livelli di acido lattico. In particolare, i pazienti mostrano un aumento significativo dei livelli di acido lattico al 30% (p<0.01), al 50% (p<0.01) e al 70% (p<0.001) della CVM rispetto ai livelli basali e al 70% (p<0.05) rispetto al 30% della CVM. Inoltre, si osserva una riduzione significativa dei livelli di acido lattico nella fase di recupero rispetto al 50% (p<0.05) e al 70% (p<0.001) della CVM.
Suddividendo i pazienti in omozigoti wild-type (GG), eterozigoti (GA) e omozigoti mutati (AA), non si osservano, nei tre gruppi, durante le varie fasi contrattili del test da sforzo, differenze statisticamente significative nei livelli plasmatici della FRAP e dei tioli; tuttavia, gli omozigoti mutati mostrano, per tutta la durata dell’esercizio fisico, livelli medi di AOPP più elevati, rispetto sia ai soggetti wild-type, che agli eterozigoti. Tale differenza risulta significativa al 50% della CVM (p<0.05, GG vs AA; p=0.05, GA vs AA) e in corrispondenza della fase di recupero (p=0.01, GG vs AA; p<0.05, GA vs AA). Individui eterozigoti GA presentano invece livelli medi di AOPP sovrapponibili agli omozigoti wild-type. Differenze statisticamente significative, inoltre, si osservano, durante le varie fasi contrattili del test da sforzo, nei livelli plasmatici dell’acido lattico. Più precisamente, gli individui omozigoti mutati mostrano incrementi significativi dei livelli di acido lattico al 30% (p<0.01) e al 50% (p<0.001) della CVM, rispetto ai soggetti con genotipo wild-type. Anche gli individui eterozigoti, a questi due steps, mostrano un lieve aumento dei livelli di acido lattico rispetto agli omozigoti wild-type, ma queste differenze non risultano significative.
In conclusione, i dati relativi al polimorfismo in esame, 1444 G>A (Gly482Ser), fanno supporre che lo SNP non rappresenti un fattore di suscettibilità genetica per la SLA. I risultati ottenuti dal confronto dei diversi markers di stress ossidativo tra pazienti sSLA e relativi controlli, confermano il coinvolgimento dello stress ossidativo nella malattia; lo SNP Gly482Ser non sembra essere implicato nelle variazioni dei livelli plasmatici basali dei biomarcatori di stress ossidativo analizzati. Nonostante sia noto da tempo che l’esercizio fisico incrementa, nell’immediato, la produzione dei radicali liberi, il test da sforzo incrementale eseguito dai pazienti in esame non ha avuto alcun effetto sui livelli plasmatici dei biomarcatori AOPP, FRAP e tioli, mentre induce variazioni dei livelli di acido lattico. Infine, i risultati ottenuti, suddividendo i pazienti in omozigoti per la variante allelica rara A (genotipo AA), eterozigoti (genotipo GA) e omozigoti per l’allele comune (genotipo GG) fanno ipotizzare che la presenza della variante allelica rara A, possa concorrere ad incrementare il danno ossidativo alle proteine e l’accumulo di acido lattico durante l’attività fisica.