• cellule progenitrici endoteliali
• diabete mellito tipo 2
• HDL

Background: Ridotti livelli di colesterolo HDL rappresentano un fattore di rischio indipendente per la disfunzione dell’endotelio, condizione comune a tutte le malattie cardiovascolari. Le concentrazioni di HDL correlano in maniera diretta con il numero delle cellule progenitrici endoteliali circolanti e con la loro funzione. Le HDL potrebbero perciò esercitare protezione a livello dell’endotelio anche attraverso il miglioramento del numero e della funzione delle EPC circolanti. L’aumento delle HDL ottenuto mediante trasferimento genico aumenta il numero delle EPC circolanti e ha effetti favorevoli sulle loro capacità di migrazione e di adesione valutate ex-vivo.
Tuttavia, in vitro, le HDL potrebbero avere effetti vascolari bifasici dose-dipendenti, paradossalmente compromettendo alcune funzioni delle EPC a moderate ed alte concentrazioni.

Il diabete tipo 2 integra aspetti diversi della relazione tra HDL e cellule endoteliali. La disfunzione endoteliale è elemento caratteristico del diabete tipo 2. Sia le HDL che le EPC provenienti da pazienti con diabete si presentano “disfunzionali”. Le HDL di pazienti con diabete vedono compromessi sia gli effetti favorevoli sulla vasodilatazione endotelio-dipendente che la loro capacità di sostenere la riparazione endoteliale mediata dalle EPC.


Obiettivi: Scopo dello studio è stato valutare ex vivo la relazione tra concentrazioni di colesterolo HDL e proprietà funzionali di cellule progenitrici endoteliali isolate da cellule mononucleate ottenute da sangue periferico di soggetti con diabete mellito tipo 2.


Pazienti e Metodi: Sono stati reclutati 119 soggetti con diabete tipo 2 con età superiore a 35 anni, livelli di HDL persistentemente inferiori o superiori a 40 (se maschi) o 50 mg/dl (se femmine) valori di emoglobina glicata persistentemente inferiori a 9%. Le cellule mononucleate di sangue periferico sono state isolate mediante centrifugazione a gradiente di densità. Un totale di 2.5 x 106 cellule mononucleate per cm2 sono state coltivate su piastre ricoperte da fibronectina. Dopo 3 giorni di coltura il supernatante e le cellule non aderenti sono stati rimossi e le cellule adese identificate in quinta giornata come early EPC. In 12 esperimenti distinti sono state valutate la vitalità delle EPC mediante test MTT, la capacità di adesione su fibronectina, la senescenza mediante colorazione alla beta-galattosidasi, la migrazione utilizzando VEGF umano come chemo-attrattante e, infine, la produzione dei ROS. Le “early EPC” adese sono state caratterizzate e selezionate mediante microscopia a fluorescenza per la loro capacità di captazione di LDL acetilate marcate, Dil-ac-LDL, e di lectina. Sono state inoltre ulteriormente definite dimostrando tramite citofluorimetria la espressione di CD31, vWf, KDR, VE-chaderin e CD14.

Risultati: Sono stati reclutati in maniera consecutiva 119 soggetti con diabete tipo 2, 59 con HDL superiori a 40/50 mg/dl e concentrazioni medie di HDL pari a 73 mg/dl e 60 con HDL inferiori a 40/50 mg/dl e valori medi di HDL pari a 33 mg/dl. I soggetti con basse HDL erano più frequentemente maschi, avevano più breve durata del diabete, più elevati BMI, circonferenza vita e pressione arteriosa diastolica, più elevate concentrazioni di colesterolo totale e di trigliceridi. Tra i due gruppi non vi erano differenze per glicemia a digiuno, emoglobina glicata e colesterolo LDL. Tra i due gruppi non vi erano differenze per funzione renale, transaminasi e gammaGT, prevalenza di ipertensione arteriosa e di trattamento con statine e/o ezetimibe. I soggetti con basse HDL presentavano più elevati livelli di acido urico, erano più frequentemente trattati con anti-ipertensivi ed erano più spesso fumatori attivi.

I soggetti con basse HDL rispetto a quelli con elevate HDL presentavano una riduzione significativa, pari al 19% della vitalità delle EPC circolanti. La vitalità delle EPC è stata rivalutata dopo esposizione per 1 ora al perossido di idrogeno in 20 soggetti con elevate HDL ed in 19 pazienti con basse HDL. In entrambi i gruppi, la vitalità dopo stress ossidativo correlava in maniera diretta con la vitalità basale. Dopo esposizione a perossido di idrogeno la vitalità diventava simile nei due gruppi, ma la sua riduzione percentuale era maggiore (32%) nelle EPC dei soggetti con elevate HDL rispetto alle EPC dei soggetti con basse HDL (18%).

Al contrario, la senescenza delle cellule progenitrici endoteliali di soggetti con basse HDL non mostrava alcuna differenza rispetto a quella delle cellule progenitrici provenienti da diabetici tipo 2 con alte HDL. In entrambi i gruppi, anche la senescenza delle EPC è stata rivalutata dopo esposizione al perossido di idrogeno. In entrambi i gruppi, la senescenza dopo stress ossidativo correlava in maniera diretta con la senescenza basale. In entrambi i gruppi, nelle nostre condizioni sperimentali, la senescenza non era modificata dall’esposizione allo stress ossidativo.

Analogamente, le EPC di soggetti con basse HDL rispetto a quelle di pazienti con elevate HDL non presentavano alcuna differenza nella capacità di adesione alla fibronectina o nella capacità di migrazione valutata utilizzando il VEGF umano come chemo-attrattante. Sovrapponibili erano anche le produzioni dei ROS.

Per valutare l’eventuale effetto paradosso di livelli di HDL particolarmente elevati, vitalità ed adesione delle EPC sono state anche analizzate dopo stratificazione per quartili delle concentrazioni delle HDL. Le EPC provenienti da soggetti con livelli di HDL compresi nel quarto quartile (Q4) presentavano vitalità significativamente migliore rispetto a Q1 e Q2. Sia la vitalità che la capacità di adesione erano significativamente più elevate in Q4 rispetto all’insieme dei soggetti compresi nei quartili Q1-Q3. Nessuna differenza tra quartili di HDL è stata descritta per senescenza, migrazione e produzione di ROS.

In analisi di regressione logistica, covariate indipendenti della vitalità stratificata in funzione della mediana sono risultati emoglobina glicata e colesterolo HDL. La vitalità delle EPC aumenta al ridursi dei valori di HbA1c ed aumenta all’aumentare dei livelli del colesterolo HDL. Covariate indipendenti della capacità di adesione sono risultate colesterolo HDL e indice di massa corporea con l’adesione che migliora all’aumentare delle HDL e si riduce all’aumentare dell’IMC.

Covariate indipendenti della senescenza sono risultate emoglobina glicata e indice di massa corporea, con la senescenza che diventa più evidente all’aumentare dell’emoglobina glicata e tende a migliorare, in maniera non facilmente spiegabile, all’aumentare dell’IMC. In regressione logistica, nessun fattore è risultato associato in maniera indipendente alla migrazione ed alla produzione di ROS.


Conclusioni: Nel diabete tipo 2 …

… la vitalità delle EPCs valutata ex-vivo tende ad aumentare con l’aumentare delle concentrazioni plasmatiche delle HDL ed è ridotta in presenza di stress ossidativo;

… la capacità di adesione alla fibronectina è maggiore nelle EPCs provenienti dai soggetti con i più elevati valori di HDL;

… per entrambi i parametri non sono stati osservati effetti bifasici dose-dipendenti;

… in regressione logistica i livelli di colesterolo HDL emergono quale covariata indipendente di vitalità e capacità di adesione;

… i livelli di HDL non sembrano influenzare senescenza, capacità di migrazione e produzione dei ROS.


Elevati livelli di colesterolo HDL sono associati in pazienti con diabete mellito tipo 2 a preservazione di alcune delle proprietà funzionali delle cellule progenitrici endoteliali circolanti valutate ex vivo.

In soggetti con diabete mellito tipo 2 elevati livelli di colesterolo HDL potrebbero essere determinanti indipendenti della funzionalità delle cellule progenitrici endoteliali contribuendo quindi, verosimilmente anche attraverso questo meccanismo, alla protezione cardiovascolare.