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Tesi etd-08272014-174425


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
PONTI, MARCO
URN
etd-08272014-174425
Title
Nerve Growth Factor a ridotta azione nocicettiva: Modulazione della neuro infiammazione in un modello della malattia di Alzheimer
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Supervisors
relatore Prof. Cattaneo, Antonino
tutor Prof.ssa Capsoni, Simona
correlatore Prof. Dal Monte, Massimo
correlatore Prof. Pasqualetti, Massimo
Parole chiave
  • Cattaneo
  • Capsoni
  • somministrazione sistemica ngfp
  • cavita' nasale
  • sistema del complemento
  • integrine cd11c/cd18
  • cellule iba+
  • cellule iba+cd11c+
  • cellule iba+cd11c+abeta+
  • ad11
  • numero cellule per campo iba+
  • numero cellule per campo iba+cd11c+
  • numero cellule per campo iba+cd11c+abeta+
  • analisi ad una varianza
  • bonferroni
  • t-test due code
  • T cross Kruskal-Wallis
  • imaris
  • filament
  • imagj
  • fettine free floating
  • distribuzione normale
  • abeta frazione solubile
  • abeta frazione insolubile
  • processamento app
Data inizio appello
20/10/2014;
Consultabilità
Secretata d'ufficio
Data di rilascio
20/10/2084
Riassunto analitico
La malattia di Alzheimer (AD) è un neurodegenerazione che colpisce la popolazione anziana ed è caratterizzata dalla formazione di placche di proteina β amiloide, grovigli della proteina tau e deficit di innervazione colinergica. Nel Sistema Nervoso Centrale le efferenze colinergiche del prosencefalo basale proiettano alla corteccia e all’ippocampo. Queste proiezioni colinergiche sono implicate in funzioni cognitive superiori come la memoria e l’apprendimento. I neuroni colinergici del prosencefalo basale sono la popolazione target più sensibile al Nerve Growth Factor (NGF), in quanto esprimono sia i recettori TrkA che p75NTR. NGF è trasportato in modo retrogrado dall’ippocampo e dalla corteccia, dove è sintetizzato, ai corpi cellulari del prosencefalo basale tramite trasporto retrogrado mediato dal recettore TrkA. Nella malattia di Alzheimer è stata osservata una ridotta espressione di TrkA nelle prime fasi della malattia che porta ad un’alta concentrazione di NGF a livello della corteccia e dell’ippocampo in cervelli di pazienti AD analizzati post mortem, invece una minor immunoreattività dell’NGF nel prosencefalo basale, suggerendo un difetto del trasporto retrogrado di NGF in AD. Studi su encefali di primati allo stadio adulto hanno consolidato l’ipotesi di un’azione neurotrofica e neuro protettiva esercitata dall’NGF, come studi preliminari ad una applicazione terapeutica nel’uomo. Questi studi hanno consentito di iniziare trials clinici in pazienti AD. Tuttavia l’NGF ha due limiti terapeutici: il primo è che non può attraversare la barriera ematoencefalica a causa della sua dimensione e della sua carica. Il secondo è che l’NGF ha un’ azione pro-nocicettiva sui neuroni sensoriali dei gangli della radice dorsale sui quali modula la trasmissione del segnale dolorifico e ha un azione pro-infiammatoria sulle cellule mediatrici dell’infiammazione (inclusi i mastociti). Questi limiti fanno si che gli attuali trial clinici vengano eseguiti impiantando cellule ingegnerizzate a secernere NGF direttamente nel prosencefalo basale dei pazienti. Si tratta quindi di tecniche neurochirurgiche altamente invasive. Il nostro laboratorio sta perseguendo una strategia diversa per la somministrazione di NGF. Il limite della barriera ematoencefalica può essere superato con un metodo non invasivo come la somministrazione intranasale. Questo metodo si serve della innervazione del bulbo olfattivo da parte dell’epitelio olfattivo che si trova nella cavità nasale e della connessione diretta fra bulbo olfattivo e le altre cortecce basali. Il secondo limite terapeutico è superato grazie alla produzione dell’NGF “painless” hNGFP61S/R100E. Questo mutante dell’NGF umano mantiene la segnalazione neurotrofica, ma mostra una riduzione della segnalazione coinvolta nella sensibilità del nocicettore e nella percezione del dolore. La forma NGF “painless” è stata derivata dalla rara malattia genetica umana Neuropatia Ereditaria Autonomica e Sensoriale di tipo V (HSAN V), dove l’arginina in posizione 100 è sostituita con il triptofano (hNGFR100W). Questa mutazione miss senso a singolo nucleotide determina la completa perdita della sensazione dolorifica senza effetti sulle funzioni cognitive. Il mutante ingegnerizzato R100E ha proprietà di legame simili al mutante R100W. Sia R100W che R100E hanno una ridotta attività nocicettiva in vivo rispetto a hNGF wilde type. hNGFP61S, detto hNGF “tagged”, sostituisce il residuo di prolina in posizione 61 dell’NGF umano con il residuo di serina presente in NGF di topo, rendendo così l’NGF umano ricombinante (hNGFP61S) detettabile con uno specifico anticorpo monoclonale. Il risultante doppio mutante hNGFP61S/R100E è espresso e purificato da E. coli. Nel nostro lavoro l’hNGF “painless” è stato somministrato a topi 5XFAD. Questi sono una linea di topi transgenica che coesprime la proteina precursore dell’amiloide (APP) umana con tre mutazioni presenti nella forma genetica di AD (FAD) (K670N/M671L, I716V e V717I) e presenilina 1 (PS1) umana con due mutazioni FAD (M146L e L286V) sotto il promotore specifico neuronale Thy1. I topi 5XFAD cominciano a sviluppare placche di amiloide simile a quelle di AD a circa 2 mesi di età. Il fenotipo patologico dei 5XFAD consiste in placche di amiloide, gliosi e neuroinfiammazione, neurodegenerazione, deficit di memoria. In aggiunta i topi 5XFAD mostrano Aβ intraneurale e una perdita di neuroni, caratteristica fondamentale di AD mancante in molti modelli transgenici. Lo scopo dello studio effettuato durante la mia tesi è stato: 1) verificare che l’NGF “painless” riducesse la neurodegenerazione anche nei topi 5xFAD 2) verificare se, oltre a ridurre l’accumulo di β amiloide, NGF “painless” fosse in grado di influenzare la morfologia il numero e l’espressione di marcatori di fagocitosi nella microglia. I risultati ottenuti dai nostri studi evidenziano una riduzione delle placche di Aβ osservata con immunoistochimica ed ELISA. Inoltre abbiamo dimostrato che NGF “painless” è in grado di riattivare la microglia inducendo fagocitosi di β amiloide. I risultati di questa tesi permettono quindi di evidenziare per la prima volta un’azione diretta anti infiammatoria dell’NGF “painless”.
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