• ciliopathy
• TALEN
• DNAH11
• lentiviral vectors

Riassunto

La discinesia ciliare primitiva (DCP) è una malattia genetica rara, autosomica e recessiva, che affligge globalmente circa 400.000 persone. La DCP è caratterizzata da disfunzione del movimento ciliare degli epiteli. Difetti nella motilità ciliare portano ad una scarsa clearance muco ciliare che danneggia la funzionalità polmonare, ad asma cronica, ed a serie infezioni respiratorie. La cura è solo sintomatica ed estrapolata da altre patologie del cavo orale. Molte speranze sono quindi riposte nella terapia genica.
Questo lavoro di tesi è finalizzato allo sviluppo di un nuovo approccio di terapia genica per la DCP. Vi è una lunga lista di geni implicati nella struttura e movimento ciliare e che sono stati quindi associati a DCP. In questo studio ci siamo focalizzati su DNAH11, studiato dalla sezione di Pneumologia ed Allergologia Pediatrica dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Pisa con cui abbiamo collaborato per questo studio. Tra i pazienti afferenti a questo centro sono stati scelti quindi soggetti con mutazioni che inattivano il gene DNAH11 che codifica per la catena pesante della dineina 11, componente essenziale della struttura ciliare.
Sono state allestite colture cellulari di cellule ciliate prelevate tramite brushing da due pazienti con mutazioni non-senso in DNAH11. Si è quindi cercato di correggerne il difetto genetico tramite l’utilizzo delle proteine TALEN (transcription activator-like effector nucleases): il sistema è stato disegnato per tagliare il DNA a monte del gene DNAH11, così da indurre ricombinazione sito specifica con una sequenza wild-type. Le TALEN e il frammento di DNA per la ricombinazione (Rec), sono stati forniti alle cellule tramite vettori lentivirali.
Le successive trasduzioni con i vettori lentivirali non hanno alterato la vitalità cellulare e la motilità ciliare. In un sistema surrogato su 293T si è dimostrato che le TALEN tagliano l’80% della sequenza mutata di DNAH11. Le cellule ciliate naïve di entrambi i pazienti mostravano battito ipercinetico (18-22 Hertz) che si è normalizzato (13 Hertz) in circa il 20% delle cellule dopo il trattamento con TALEN+Rec.
La presenza della proteina wild-type nel sistema surrogato è stata ricercata tramite Western blot, mentre l’avvenuta ricombinazione nelle cellule ciliate è stata monitorata tramite Digital PCR.
Avendo ripristinato tramite gene editing il normale battito ciliare, quindi, questo studio potrebbe aprire una nuova via al trattamento della DCP.


Abstract

Background Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a rare autosomal recessive genetic disorder that manifests early in life and is characterized by dysfunction of the cilia lining the respiratory tract and other epithelia. Defects in ciliary motility cause poor muco-ciliary clearance and leads to extensive impairment of pulmonary functions, chronic asthma, and severe respiratory infections. There is no specific cure and gene therapy is the only hope to treat the disease.
Objective To develop a strategy that permanently corrects the genetic defect and normalizes ciliary beating in pediatric PCD patients with mutated dynein heavy chain 11 (DNAH11), a large gene that encodes a microtubule-dependent motor ATPase and is an essential component of ciliary structure.
Methods Two patients bearing a nonsense mutation in DNAH11, provided ciliated cells that were collected by nasal brushing and placed in culture. Correction of the genetic defect was pursued by gene editing using a transcription activator-like effector nucleases (TALENs) system designed to cleave the patient’s DNAH11 sequence upstream inactivating mutation and trigger site-specific recombination with the wild-type DNAH11 sequence (Rec). TALENs and Rec were delivered in the cultured ciliated cells by lentiviral vectors.
Results Transduction with lentiviral vector did not alter viability nor ciliary motility of ciliated cells cultured ex-vivo. In a surrogate system, transduction of TALENs alone cleaved over 80% mutated DNAH11 sequence, and transduction of TALENs+Rec replaced mutated with wild-type sequence. Naïve ciliated cells of both patients showed hyperkinetic beat (18-22 Hertz) that was stably normalized (13 Hertz) in 25 and 10% cells upon TALENs+Rec transduction.
Conclusions Albeit validation in an animal model is warranted, this study shows that ciliary beating can be rescued by gene editing and paves the way to devise novel approaches to cure PCD.