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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-08272012-113010


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
VARANI, STEFANO
URN
etd-08272012-113010
Titolo
Effetti dell'inibizione dell'adenosina deaminasi in una linea cellulare di astrocitoma umano (ADF)
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Relatori
relatore Dott.ssa Garcia Gil, Maria De Las Mercedes
relatore Prof.ssa Camici, Marcella
Parole chiave
  • HPLC
  • western blotting
  • coltura cellulare
Data inizio appello
13/09/2012
Consultabilità
Completa
Riassunto
È noto che il dismetabolismo delle purine è associato a disfunzioni psicomotorie ma non è chiaro il legame molecolare tra le alterazioni metaboliche e le manifestazioni neurologiche. Ad esempio la deficienza di adenosina deaminasi (ADA), enzima che catalizza la deaminazione dell’adenosina e della deossiadenosina, è associata ad una grave immunodeficienza e anomalie nel funzionamento di molti organi come osso, fegato, reni e sistema nervoso. I disturbi neurologici includono disordini nella coordinazione motoria, disabilità nell’apprendimento, iperattività, epilessia e deficit uditivi. Il trapianto di midollo osseo è in grado di risolvere i problemi del sistema immunitario ma non quelli neurologici. Per lo studio dei possibili meccanismi alla base delle manifestazioni neurologiche associate alla deficienza di ADA è stato utilizzato un modello di cellule gliali, la linea ADF, derivata da un astrocitoma umano. Un modello cellulare carente di ADA è stato costruito mediante il trattamento con un inibitore di questo enzima, la deossicoformicina (dCF) e l’aggiunta di deossiadenosina (dAdo), che si accumula in assenza della suddetta attività enzimatica. Precedenti ricerche hanno dimostrato una diminuzione significativa di lattato in cellule trattate per almeno 4 h con 1 μM dCF e 120 μM dAdo rispetto ai controlli, seguita da una diminuzione della vitalità ed un aumento dell’attività della caspasi-3. Lo scopo della tesi è stato quello di approfondire lo studio del meccanismo di apoptosi indotta da dCF e dAdo. In particolare è stato investigato se sia richiesta la fosforilazione di dAdo, se ci siano variazioni della carica energetica e della funzione mitocondriale e l'eventuale coinvolgimento di specie reattive dell'ossigeno e delle caspasi-2 e 9. La vitalità delle cellule trattate con dCF + dAdo aumenta se nel terreno viene aggiunto un inibitore della adenosina chinasi, suggerendo che la dAdo deve essere fosforilata per indurre la morte cellulare. Un trattamento di 15 ore comporta una diminuzione dei livelli di ATP e della carica energetica dell'adenilato e un accumulo di dATP. La diminuzione del lattato non è dovuta ad una variazione del rapporto NAD+/NADH, che si mantiene inalterato dopo 8 h di trattamento. Nelle cellule trattate con dCF e dAdo il citocromo c trasloca dal mitocondrio al citosol, evento che normalmente comporta l'attivazione della caspasi-9. Nel nostro caso non è stato possibile riscontrare tale attivazione in accordo con risultati di altri Autori che hanno correlato la mancanza di attivazione con la presenza di una mutazione di questo enzima nelle cellule ADF. Resta ancora da individuare il meccanismo di attivazione della caspasi-3, poiché non è stata riscontrata attivazione della caspasi-2, una caspasi iniziatrice in alcune condizioni sperimentali.
In una serie di esperimenti è stata analizzata al microscopio confocale la fluorescenza associata ai mitocondri e la produzione di ROS mitocondriali mediante l'utilizzo di MitoTracker Green e MitoTracker Red CM-H2XROS rispettivamente. Il trattamento con dAdo, dCF e la combinazione di entrambi per 15 ore aumenta sia il numero di mitocondri sia la produzione di ROS mitocondriali. L'aumento di ROS non sembra causare la morte cellulare indotta da dCF + dAdo poiché si riscontra anche in trattamenti che non modificano la vitalità (dCF o dAdo singolarmente) e perché l'incubazione con antiossidanti quali N-acetilcisteina e melatonina non previene l'effetto di dCF+dAdo sulla sopravvivenza cellulare.
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