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Il gene ZNF367 appartiene alla famiglia dei fattori di trascrizione “Zinc Finger”, una classe di proteine le cui funzioni includono il riconoscimento del DNA e la regolazione trascrizionale. I geni che codificano per le proteine “zinc finger” sono conservate in tutti i vertebrati e nel genoma umano rappresentano circa il 3% dei geni. Tra le proteine di questa famiglia, note anche come proteina ZNF, la classe contenente il motivo Cys2-His2 è la più numerosa. Nonostante la maggior parte delle proteine della famiglia ZNF non sia ancora stata caratterizzata dal punto di vista funzionale, notoriamente alcune di esse ricoprono un ruolo cruciale nello sviluppo e nel differenziamento del sistema nervoso: tra loro è stata identificata ZNF367, codificata dal gene ZNF367, che occupa un ruolo centrale nel “network” di regolazione e che controlla la progressione del ciclo cellulare e la replicazione del DNA. Nel nostro laboratorio è stato inoltre osservato che l’espressione del gene ZNF367, espresso nelle cellule staminali neuronali adulte, si riduce con l’avanzare dell’età.
Il mio progetto di tesi si propone di caratterizzare il gene ZNF367 dal punto di vista funzionale nello sviluppo del sistema nervoso e nello sviluppo delle creste neurali in vivo, utilizzando una linea mutante dell’organismo modello Danio rerio generata nel nostro laboratorio tramite la tecnica CRISPR-Cas9. In particolare, il mio progetto si è focalizzato sulla caratterizzazione negli individui eterozigoti per znf367. In particolare, le analisi che ho effettuato si sono concentrate sulla quantificazione tramite qPCR dell’espressione di znf367 per valutare un eventuale abbattimento del trascritto e sulla quantificazione dell’espressione di geni potenzialmente regolati a valle di znf367 come pcna, tp53bp2, cycd1 e kif15. Ho effettuato inoltre un’analisi dell’espressione di PCNA (antigene nucleare di proliferazione cellulare) tramite ibridazione in situ (ISH) su embrioni interi per visualizzare l’espressione del trascritto in particolare al livello delle nicchie proliferative nel sistema nervoso.
Successivamente, durante il normale monitoraggio del benessere dei pesci della nostra linea mutante, ho notato negli individui eterozigoti di almeno 2 anni di età una tendenza a sviluppare delle masse addominali emorragiche. Poiché dalla letteratura è noto che ZNF367 è associato a diversi tipi di tumore, tra cui il neuroblastoma, abbiamo valutato se le masse estratte dagli individui potessero essere di natura tumorale. Ho quindi effettuato una prima caratterizzazione istologica e molecolare innanzitutto includendo le masse e tagliandole al criostato per ottenere delle sezioni su cui è stata effettuata un’immunoistochimica con gli anticorpi monoclonali anti-pH3, per valutare il grado di proliferazione cellulare, con gli anticorpi monoclonali anti-3A10, marcatori dei neurofilamenti, e anticorpi monoclonali anti-TH, diretti contro la tirosina idrossilata. Ho poi effettuato l’estrazione dell’RNA dalle masse tumorali per quantificare, tramite qRT-PCR, l’espressione di mycn (fattore prognostico per neuroblastoma) e di HuC (espresso precocemente nelle cellule neuronali e nel neuroblastoma). I dati ottenuti suggeriscono che ZNF367 potrebbe essere coinvolto nella regolazione delle regioni proliferative del sistema nervoso e che la sua mutazione potrebbe aumentare il rischio di sviluppo di tumori neuroendocrini.

English version:
The znf367 gene belongs to the “zinc finger” protein family, a proteic class whose functions include DNA recognition and trascroptional regulation. Genes coding for “zinc finger” poteins are conserved in the vertebrates and in the human genome represent 3% of all genes. Among the proteins of this family, also known as ZNF protein, the class containing the Cys2-His2 motif is the most numerous. Although most of the proteins of the ZNF family have not yet been functionally characterized, some of them notoriously play a crucial role in the development and differentiation of the nervous system: among them has been identified ZNF367, encoded by the gene ZNF367, which occupies a central role in the regulatory "network" and which controls cell cycle progression and DNA replication. In our laboratory it has also been observed that the expression of the ZNF367 gene, expressed in adult neuronal stem cells, decreases with age.
My thesis project aims to characterize the ZNF367 gene from a functional point of view in the development of the nervous system and in the development of neural crests in vivo, using a mutant line of the model organism Danio rerio generated in our laboratory through the CRISPR-Cas9. In particular, my project focused on the characterization in individuals heterozygous for znf367. In particular, the analyzes I performed focused on the quantification by qPCR of the expression of znf367 to evaluate a possible knockdown of the transcript and on the quantification of the expression of genes potentially regulated downstream of znf367 such as pcna, tp53bp2, cycd1 and kif15. I also performed an analysis of the expression of PCNA (nuclear antigen of cell proliferation) by in situ hybridization (ISH) on whole embryos to visualize the expression of the transcript in particular at the level of proliferative niches in the nervous system.
Subsequently, during routine welfare monitoring of fishes from our mutant line, I have noted a tendency to develop hemorrhagic abdominal masses in heterozygous individuals of at least 2 years of age. As it is known from the literature that ZNF367 is associated with different types of tumors, including neuroblastoma, we evaluated whether the masses extracted from individuals could be of a tumor nature. I then carried out an initial histological and molecular characterization first of all by including the masses and cutting them in the cryostat to obtain sections on which an immunohistochemistry was performed with the anti-PHH3 monoclonal antibodies, to evaluate the degree of cell proliferation, with the anti-3A10 monoclonal antibodies, neurofilament markers, and anti-TH monoclonal antibodies, directed against the tyrosine hydroxylase. The I performed RNA extraction from tumor masses to quantify, by qRT-PCR, the expression of mycn (prognostic factor for neuroblastoma) and HuC (expressed early in neuronal cells and in neuroblastoma). The obtained results suggest that ZNF367 may have an important role in the regulation of proliferative regions of the nervous system and that its mutation could increase the risk of developing neuroendocrine tumors.