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Tesi etd-08222013-192407


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
CONTE, ILARIA
URN
etd-08222013-192407
Title
Analisi di espressione del riarrangiamento KIF5B/RET in una serie selezionata di adenocarcinomi del polmone
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Commissione
relatore Prof. Basolo, Fulvio
relatore Dott. Giannini, Riccardo
Parole chiave
  • riarrangiamento
  • adenocarcinoma polmonare
  • marcatori tumorali
Data inizio appello
16/09/2013;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
16/09/2053
Riassunto analitico
Il tumore al polmone è la principale causa di morte per cancro nel mondo e conta circa 1.38 milioni di decessi all’anno. Il fumo di sigaretta costituisce il principale fattore di rischio di ammalarsi di tumore al polmone la cui incidenza è diminuita negli ultimi anni grazie ad attente campagne di prevenzioni e sensibilizzazione. Tuttavia circa il 25% dei pazienti affetti da tumore al polmone è un “non fumatore”: in particolare essi presentano un carcinoma non a piccole cellule (non small cell lung cancer, NSCLC) che rappresenta l’80% di tutti i tumori al polmone ed il cui l’istotipo dominante è l’adenocarcinoma.<br>La chirurgia e la chemioterapia sono state per molti anni le uniche misure terapeutiche disponibili ma si sono rilevate relativamente efficaci. Per questo negli ultimi anni l’approccio terapeutico in ambito oncologico è sostanzialmente cambiato: infatti, attraverso l’individuazione di alterazioni molecolari caratterizzanti il tumore stesso, si sono trovati nuovi bersagli terapeutici utili per la creazione di “terapie personalizzate” con l’uso farmaci ad essi mirati. Tali alterazioni si sono dimostrate reali marcatori tumorali aventi utilità diagnostica, prognostica e predittiva di risposta o resistenza a specifici farmaci.<br>Anche per il tumore al polmone sono state individuate alterazioni molecolari responsabili del disordine neoplastico rivelatesi sia bersagli per farmaci biologici che marcatori tumorali; tali alterazioni sono a carico dei geni EGFR, K-Ras ed ALK. In particolare le mutazioni che coinvolgono EGFR ed il riarrangiamento di ALK con EML4 (EML4-ALK) sono sia bersagli di specifici farmaci che marcatori predittivi di risposta mentre quelle a carico di K-Ras sono predittive di resistenza ai farmaci anti-EGFR.<br>Recentemente, grazie al sequenziamento dell’intero genoma, è stato identificato un nuovo marcatore tumorale: si tratta del riarrangiamento genico KIF5B-RET identificato nel 1-2% degli adenocarcinomi definiti “tripli-negativi” ovvero che presentano un genotipo wild-type per EGFR e K-Ras e negativi per EML4-ALK. Tale riarrangiamento è frutto della fusione tra il gene KIF5B ed il proto-oncogene RET conseguente ad un’inversione pericentrica a livello del cromosoma 10. Tale alterazione genica comporta l’aumento di espressione della proteina di fusione che è risultata importante bersaglio per uno specifico farmaco, farmaco che offre un’ulteriore possibilità cura per i pazienti che non possono essere trattati con altri farmaci in quanto per loro inefficaci.<br>Il principale scopo di questa tesi e quindi del lavoro a cui ho preso parte presso il laboratorio di Anatomia Patologica III Universitaria dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana, è stato quello di validare un nuovo approccio per l’individuazione dell’espressione del gene di fusione KIF5B-RET partendo da RNA purificato da sezioni di tessuto fissato in formalina ed incluso in paraffina (FFPE). Ulteriore obiettivo di questo lavoro è stato quello di dimostrare l’applicabilità di tale metodica non solo su campioni FFPE ma anche su campioni citologici: dimostrare ciò è importante non solo perchè quest’ultimi spesso rappresentano l’unica tipologia di materiale biologico disponibile per le analisi diagnostiche di routine ma anche perché la quantità di RNA che da essi può essere estratta è molto bassa. Dopo opportuna quantificazione e retrotrascrizione dell’RNA estratto, è stata effettuata una Real Time-PCR attraverso l’utilizzo di specifici primers disegnati per consentire l’amplificazione delle diverse varianti del riarrangiamnento ove presenti. Ottenuta una PCR positiva, attraverso un’elettroforesi capillare si è accertato che le dimensioni dell’amplicone corrispondessero a quelle aspettate ed infine la presenza e la specificità del riarrangiamento è stata ulteriormente confermata dal sequenziamento con metodo Sanger. Contestualmente a questo lavoro nel laboratorio gli stessi campioni sono stati sottoposti ad analisi FISH.<br>I tests condotti su 49 adenocarcinomi wild-type per EGFR, K-Ras e negativi per EML4-ALK hanno rivelato la presenza di un paziente positivo per la variante 1 di KIF5B-RET sia sul prelievo FFPE che citologico, inoltre la presenza del trascritto di fusione è stata confermata dall’analisi FISH. Complessivamente la frequenza del riarrangiamento è risultata essere in linea con quella già riscontrata in altre serie di adenocarcinomi e riportata in letteratura. <br>In conclusione entrambi gli obiettivi prefissati per questo lavoro sono stati raggiunti con successo: a) è stata infatti dimostrata la possibilità di individuare, mediante l’applicazione delle tecniche di biologia molecolare sopra descritte, l’espressione del gene di fusione KIF5B-RET partendo da RNA purificato da campioni FFPE; b) è stata confermata la possibilità di applicare questo approccio metodologico anche su campioni citologici. <br>L’importanza dell’aver dimostrato l’applicabilità di tale metodo è messa in luce dal fatto che sempre più spesso questa analisi viene richiesta dagli oncologi al nostro laboratorio: rilevare la positività al riarrangiamento KIF5B-RET significa infatti dare ai pazienti che non rispondono al trattamento con altri farmaci, un’ulteriore possibilità di cura attraverso la somministrazione di un farmaco specifico.<br>
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