• carcinoma papillare tiroideo
• LGALS3
• Pro64His

Il cancro della tiroide è la neoplasia più frequente del sistema endocrino, pur rappresentando meno dell’1% di tutte le neoplasie maligne. In base alle caratteristiche cliniche, morfologiche e molecolari, i carcinomi della tiroide vengono suddivisi in due gruppi: il carcinoma differenziato (DTC), che comprende gli istotipi papillare, follicolare e midollare, ed il carcinoma indifferenziato o anaplastico. Come per la maggior parte delle neoplasie, anche per i tumori tiroidei l’eziologia è di tipo multifattoriale, risultante da una complessa interazione tra fattori ambientali e fattori genetici. Dal punto di vista genetico, è stato dimostrato che la diversa suscettibilità allo sviluppo di tumori è associata alla presenza di loci polimorfici, spesso determinati da polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs). Il lavoro condotto in questa tesi propone di valutare, mediante uno studio di associazione di tipo caso-controllo condotto su un campione costituito da 1155 casi e 1222 controlli, se il polimorfismo Pro64His (rs4644, c.191C>A, p.P64H) presente nel terzo esone del gene LGALS3 sia associato al tumore tiroideo differenziato. Il gene LGALS3 codifica per la galectina-3, una proteina espressa nei tireociti che hanno subito una trasformazione maligna e che è coinvolta in numerosi processi biologici, quali la regolazione del ciclo cellulare, l’apoptosi, il differenziamento e l’invasività delle cellule tumorali. La scelta del polimorfismo rs4644 è stata fatta attraverso precisi criteri di selezione indirizzati verso i geni che presentano degli SNPs con un cambiamento amminoacidico che coinvolge la prolina, in considerazione della sua peculiare struttura chimica.
Il lavoro sperimentale prevede l’estrazione del DNA dai campioni di sangue, l’amplificazione dello SNP d'interesse con una coppia di primers opportuna, la digestione con enzima di restrizione al fine di effettuare l’analisi degli RFLP (restriction fragment lenght polymorphism). I dati ricavati sono poi sottoposti ad analisi statistica al fine di verificare l’associazione tra lo SNP e il rischio di insorgenza del carcinoma papillare tiroideo. Per valutare un eventuale ruolo funzionale del polimorfismo in questione, abbiamo effettuato dei saggi in vitro utilizzando come modello cellule TPC1 di carcinoma papillare tiroideo trasfettate con un plasmide esprimente l'intera sequenza codificante del gene LGALS3 con la variante C o, alternativamente, la variante A del polimorfismo Pro64His. Infine, mediante real-time qPCR è stata indagata l'azione del polimorfismo in esame sull’espressione di geni opportunamente selezionati.
I risultati dell’analisi statistica condotta sullo SNP rs4644 in relazione al rischio d'insorgenza del carcinoma tiroideo (NMTC) mostrano un ruolo protettivo del genotipo A/A nei confronti dell’insorgenza della malattia, con Odd ratio pari a 0,66 (IC 95% 0,46-0,93). Inoltre, dai risultati della real-time si evince che l’espressione di alcuni geni possa essere influenzata in maniera differenziale dalle due varianti alleliche “A” e “C” dello SNP rs4644. In particolare, i geni MSH2 e MDM2 risultano sovraespressi in presenza della variante C rispetto alla variante A. Da una parte, l’aumento dell’espressione di MSH2 può essere spiegato dalla necessità della cellula di attivare meccanismi di riparazione per riparare danni al DNA responsabili della trasformazione maligna delle cellule; dall’altra, l’aumento dell’espressione di MDM2 è ragionevolmente spiegato dal fatto che esso agisce inibendo e degradando la proteina soppressore-tumorale p53, favorendo in tal modo la progressione tumorale. A seguito dei risultati ottenuti nello studio caso-controllo, rinforzati dalle informazioni ricavate dallo studio funzionale, si può affermare che la galectina-3 riveste un ruolo biologico importante nel processo di cancerogenesi della tiroide su cui effettuare ulteriori studi.


--- ABSTRACT

Thyroid tumor is the most common endocrine malignancy, although representing less than 1% of all human cancers. According to its morphology and biologic characteristics thyroid cancer is classified into two main types: differentiated thyroid carcinomas (DTC), that includes the papillary, follicular and medullary histotypes, and indifferentiated or anaplastic thyroid carcinomas (ATC).
The etiology of thyroid tumors results from the interactions between genetic and environmental factors; among genetic factors, it has been demonstrated that the susceptibility to thyroid cancer is often associated with the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs). The aim of this study is to assess if the polymorphism Pro64His (rs4644, c.191C>A, p.P64H) in the third exon of the LGALS3 gene is associated with susceptibility to develop thyroid cancer. LGALS3 encode for galectin-3, a protein expressed in malignant thyrocytes and involved in numerous biological processes, such as cell cycle regulation, apoptosis, cell differentiation, and metastasis.
We conducted a case-control study on a series of 1155 patients with DTC and 1222 healthy controls. The study is based on different phases that include the extraction of DNA from blood samples, amplification of the sequence of interest by PCR and, finally, the analysis of RFLP (restriction fragment length polymorphism) by the digestion with an appropriate restriction enzyme.
The association between the SNP and thyroid cancer susceptibility is then evaluated with the multivariate logistic regression analysis. In order to elucidate a possible functional role of the polymorphism of interest we also have conducted in vitro assays using the papillary thyroid carcinoma cell line TPC1. The cells were transfected with a plasmid vector containing the coding sequence of LGALS3 gene with the variant C or, alternatively, the variant A at the position 191 of the coding sequence. The role of the SNP on the expression of a set of target genes has then been evaluated by real-time qPCR.
The results obtained from the case-control study revealed a protective role of the genotype A/A in relation to the risk of development thyroid carcinoma (NMTC) (OR=0,66; 95% CI=0,46-0,93). Furthermore, the results obtained from real-time qPCR assays revealed a functional role of the polymorphism on the expression of MSH2 and MDM2 genes, which result overexpressed in relation to the C allele. The overexpression of MSH2 may be due to the necessity to repair DNA damages responsible of malignant transformation in papillary carcinoma cells; on the other hand, the overexpression of MDM2 in transformed thyroid cells is likely attributable to its role in promoting the tumorigenesis process by inhibiting and degrading the tumor-suppressor protein p53. In conclusion, these results suggest that future prospective studies are needed to elucidate the potential role of the galectin-3 in the process of thyroid cells transformation.