• 6-TG
• DEB
• DSB
• FACS
• GLA
• HPRT1
• HRR
• ICL
• resorufina alpha-D-galattopiranoside
• vettore HR410PA-1

L’1,2:3,4-diepossibutano (DEB) è un agente alchilante con proprietà citotossiche e mutagene, derivato metabolico dell’1,3-butadiene (BD), in grado di indurre la formazione di DNA-DNA intrastrand e interstrand crosslink (ICL), interferendo così con i processi di trascrizione e replicazione. I meccanismi attraverso i quali le cellule riparano gli ICL sono oggetto di ricerca attiva ma si ritiene che questi possano essere convertiti in rotture del doppio filamento di DNA (double strand break, DSB). La cellula risponde a quest’ultimo con due diversi meccanismi di riparazione: il Non-Homologous End-Joining (NHEJ), meccanismo error-prone che giustappone le estremità rotte e le riunisce con una legatura del DNA e l’Homologous Recombination Repair (HRR), meccanismo che si avvale del processo di ricombinazione omologa (HR) e della presenza di un filamento stampo per riparare i DSB. Sono meccanismi atti non solo a preservare le funzioni cellulari ma anche a garantire una corretta trasmissione delle informazioni genetiche alle cellule figlie. È risaputo che il DEB, similmente alla mitomicina C, è in grado di stimolare l’HRR come dimostrato dall’induzione massiva di scambi tra cromatidi fratelli (Sister Chromatid Exchange, SCE) in svariati sistemi eucarioti.
È noto che le lesioni di tipo ICL e DSB sono riparate localmente dai sistemi sopra menzionati. Tuttavia, non è noto se l’attivazione dell’HRR possa coinvolgere il genoma nella sua interezza, anche là dove non sono presenti lesioni. Abbiamo ipotizzato che se questa situazione dovesse verificarsi, un eventuale DNA esogeno (somministrato ad esempio mediante la trasfezione di un vettore) potrebbe essere processato dall’HRR e integrarsi in maniera sito-specifica anche in assenza di lesioni sul sito di interesse. Se si riuscisse a dimostrare che la stimolazione dell’HRR possa indurre un incremento di gene-editing guidato dall’omologia di sequenza, si aprirebbero delle alternative interessanti che potrebbero portare a rimpiazzo di segmenti genici innescato da piccole molecole chimiche, in altre parole da farmaci.
Il presente progetto di tesi ha lo scopo di mettere a punto saggi sperimentali per la rilevazione di una possibile attività “globale” dell’HRR, a seguito dell’induzione mutagena di DEB, confrontando gli eventi locus-specifici quando il trattamento è effettuato in assenza o in presenza di uno specifico vettore.
Per far ciò è stata utilizzata la linea cellulare maschile HCT-116 (cellule di carcinoma del colon-retto) e sono stati bersagliati i loci del cromosoma X: HPRT1 (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi 1) e GLA (α-galattosidasi A). Questi loci permettono la rilevazione dei mutanti mediante saggio, rispettivamente, con agente selettivo o fluorimetrico.
Le cellule sono state trattate con DEB e trasfettate con il vettore HR410PA-1 che contiene le braccia di omologia locus-specifiche fiancheggianti una cassetta esprimente GFP e un marcatore di selezione responsabile della resistenza alla puromicina.
Nel primo saggio sperimentale le braccia di omologia del vettore sono specifiche per il gene HPRT1 che mappa in posizione Xq26.2-q26.3 e codifica per l’enzima ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi 1 (HGPRT1), coinvolto nel pathway di recupero delle purine. La selezione delle cellule mutanti viene condotta tramite l’uso di 6-tioguanina (6-TG), un analogo tossico delle purine che se incorporato tramite l’HGPRT1 provoca morte cellulare. Quindi, nelle cellule mutanti HPRT1-, in cui il DNA ricombinante si è correttamente integrato, la 6-TG non viene incorporata e le cellule sopravvivono formando colonie, mentre nelle cellule wild-type (wt) la 6-TG incorporata esplica la sua azione citotossica e le cellule vanno incontro a morte.
Nel secondo saggio sperimentale le braccia di omologia del vettore sono specifiche per il gene GLA, locus dell’α-galattosidasi A, che mappa in posizione Xq22.1. In questo caso, l’inserzione del DNA ricombinante interrompe l’integrità strutturale e funzionale dell’unica copia del gene (GLA-). Il rilevamento è stato condotto tramite l’uso di resorufina α-D-galattopiranoside, un substrato fluorogenico che genera una fluorescenza rossa a seguito dell’interazione con la proteina α-galattosidasi A. Quindi, nelle cellule wt il substrato viene metabolizzato e si osserva una fluorescenza rossa, mentre nelle cellule GLA- la proteina α-galattosidasi A non viene sintetizzata ed il substrato non metabolizzato. Le cellule sono state selezionate in puromicina ed analizzate al Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS).
Complessivamente i risultati ottenuti sembrano indicare che l’HRR non manifesti un’attività “globale” ma probabilmente ha un’azione limitata al sito del danno.