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Tesi etd-08102020-114822


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
BOGANI, LUCIA
URN
etd-08102020-114822
Title
L'ablazione genica della idrolasi NAAA interferisce con la replicazione del virus Zika
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Supervisors
relatore Prof. Lai, Michele
relatore Prof.ssa Freer, Giulia
Parole chiave
  • NAAA
  • PEX
  • PPAR alfa
  • PPARalpha
  • autofagia
  • autophagy
  • Zika virus
Data inizio appello
21/09/2020;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
21/09/2023
Riassunto analitico
La N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA) è un enzima di 359 amminoacidi appartenente alla famiglia delle choloylglycine hydrolase; viene attivato proteoliticamente in una forma più corta a pH 4.5-5 e localizza in vescicole endosomiche. Il suo ruolo è quello di idrolizzare alcune etanolammidi, avendo come substrato preferenziale la palmitoiletanolammide (PEA).
La PEA è una molecola con numerose proprietà farmacologiche di spiccato interesse clinico: ha attività analgesica, antinfiammatoria, neuroprotettiva e immunosoppressiva.
In questo lavoro di tesi vogliamo valutare la possibile correlazione tra l’incremento della PEA intracellulare indotto dalla soppressione di NAAA e la replicazione di virus neurotropici: in particolare, abbiamo utilizzato il virus Zika.
Il potente effetto analgesico e antipiretico della PEA potrebbe sia proteggere il sistema nervoso centrale durante le infezioni virali, tenendo sotto controllo la risposta immunitaria, sia esercitare un’azione diretta verso la replicazione virale, potenziando la sintesi dei perossisomi o incrementando l’autofagia.
Per testare la nostra ipotesi sperimentale, abbiamo utilizzato la tecnica CRISPR/Cas9 per generare una linea cellulare difettiva nel gene ASAHL, codificante per l’enzima NAAA. L’editing genetico è stato effettuato su una linea di cellule epiteliali basali alveolari umane di adenocarcinoma (A549). Abbiamo scelto di procedere con l’editing genetico su questa linea cellulare in quanto infettabile dal virus Zika e sovra-esprimente l’enzima NAAA. Abbiamo quindi selezionato due cloni di A549-ASAHL mutati per i successivi esperimenti.
Allo scopo di valutare l’effetto antivirale dato dall’assenza di NAAA, abbiamo infettato i cloni difettivi con 1 MOI del virus Zika. Questo virus è stato scelto in quanto possiede come unico meccanismo di ingresso l’endocitosi.
I dati ottenuti attraverso saggi molecolari e cellulari hanno evidenziato una riduzione del titolo virale statisticamente significativa nei cloni difettivi di NAAA. In particolare, abbiamo osservato una riduzione della quantità di proteine virali intracellulari e una parallela diminuzione della carica virale nei surnatanti delle linee NAAA difettive. Sorprendentemente, le linee NAAA KO possiedono un livello di autofagia basale statisticamente più alto rispetto alle linee di controllo, l’incremento del processo autofagico è ancora più evidente a seguito dell’infezione virale.
Nonostante il ruolo dell’autofagia durante l’infezione da Zika sia ancora dibattuto, stiamo valutando come questo possa motivare la forte riduzione del titolo virale.
In conclusione, i risultati esposti nel presente lavoro esplorano un meccanismo antivirale ancora non descritto in cui i livelli di espressione di una lipasi cellulare alterano la capacità infettiva di un agente virale. Per supportare quanto ottenuto sui cloni difettivi dell’enzima NAAA, sono in corso studi sulla possibile attività antivirale di farmaci in grado di inibire selettivamente e con alta potenza l’enzima NAAA.

N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA) is an enzyme of 359 amino acids belonging to the choloylglycine hydrolase family; it is proteolytically activated in a shorter form at pH 4.5-5 while it is inactive at alkaline or neutral pH and localizes in endosomal vesicles. NAAA hydrolyses some ethanolamides, having as preferred substrate the palmitoylethanolamide (PEA).
PEA is a molecule with numerous pharmacological properties of marked clinical interest: it has analgesic, anti-inflammatory, neuroprotective and immunosuppressive activity.
In this thesis we want to evaluate the possible correlation between the increase in intracellular PEA induced by NAAA suppression and the replication of neurotropic viruses: in particular, we used the Zika virus.
The powerful analgesic and antipyretic effect of PEA could both protect the central nervous system during viral infections, keeping the immune response under control, and exert a direct action towards viral replication, enhancing peroxisome synthesis or increasing autophagy.
To test our experimental hypothesis, we used the CRISPR/Cas9 technique to generate a defective cell line bearing two frame-shift mutations in the ASAHL gene, coding for the NAAA enzyme. Gene-editing was performed on a cell line of human alveolar basal epithelial cells of adenocarcinoma (A549). We chose to editthis cell line because it can be infected by Zika virus and it has high levels of the NAAA enzyme. We then selected two mutated A549-ASAHL clones for further experiments.
In order to evaluate the antiviral effect given by the absence of NAAA, we infected the defective clones with the 1 MOI of the Zika virus. This virus was chosen because it has endocytosis as its only entry mechanism.
Data obtained through molecular and cellular assays showed a statistically significant reduction in viral titer in defective NAAA clones. In particular, we observed a reduction in the amount of intracellular viral proteins and a parallel decrease in viral load in the supernatants of defective NAAA cell lines. Surprisingly, NAAA KO lines possess a statistically higher level of basal autophagy than control lines, the increase in the autophagic process being even more evident following viral infection.
Although the role of autophagy during Zika infection is still debated, we are assessing how this may motivate the strong reduction in viral titer.
In conclusion, the results presented in this work explore an as yet undescribed antiviral mechanism in which the expression levels of a cellular lipase alter the infectious capacity of a viral agent. The results obtained so far show a correlation between NAAA enzyme expression and viral replication; To support what has been obtained on defective NAAA enzyme clones, pharmacological tests with enzyme-inhibiting compounds will be performed. Studies are underway to evaluate the possible antiviral activity of drugs that selectively inhibit the NAAA enzyme with high potency and high specificity.

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