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Tesi etd-07312017-183903


Thesis type
Tesi di specializzazione (4 anni)
Author
MIGLIACCIO, FRANCA
URN
etd-07312017-183903
Title
Screening dei donatori di sangue per anticorpi anti-Plasmodium
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA
Supervisors
relatore Prof. Bruschi, Fabrizio
relatore Dott.ssa Mangano, Valentina
Parole chiave
  • anticorpi anti-Plasmodium
  • Malaria
  • donatori di sangue
Data inizio appello
20/09/2017;
Consultabilità
Completa
Riassunto analitico
RIASSUNTO
La malaria è una delle maggior emergenze sanitarie nel mondo. Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), nel 2015 oltre 3 miliardi di persone sono a rischio di contrarre la malaria e 91 Paesi dall’inizio del 2016 ne sono endemici. La malaria è causata dal protozoo del genere Plasmodium, di cui 5 specie sono patogene per l'uomo: P. falciparum, P. ovale, P. vivax, P. malariae e P. knowlesi, di più recente identificazione.
Il Plasmodio è naturalmente trasmesso all’uomo attraverso la puntura di una zanzara femmina infetta del genere Anopheles. Ma, il parassita può essere introdotto nell'organismo attraverso altre modalità di trasmissione, seppure meno frequenti, come le trasfusioni di sangue, i trapianti d’organo, gli aghi contaminati e la trasmissione trasplacentare.
Secondo l'OMS, i Paesi più endemici per malaria, sono quelli della Regione africana, del Sud-Est asiatico e della Regione del Mediterraneo orientale.
Mentre nei paesi endemici, l'emergenza sanitaria è rivolta, soprattutto, alla diagnosi e al trattamento precoce della malaria, nei paesi non endemici, è rivolta alla prevenzione e al controllo della malaria di importazione e a quella causata accidentalmente, come, per esempio, da trasfusione di sangue ed emocomponenti, proveniente da donatori asintomatici infetti da Plasmodium.
Diversi paesi, compreso l'Italia, hanno adottato delle misure di prevenzione per la sicurezza trasfusionale, emanando linee guide per lo screening dei donatori di sangue, che provengono da Paesi endemici per malaria o che vi hanno soggiornato. Attualmente, la Regolamentazione Europea, attraverso l’European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare (EDQM), raccomanda lo screening dei candidati donatori di sangue per anticorpi anti-Plasmodium, con un test sierologico. In Italia, la regolamentazione europea è stata recepita attraverso il Decreto Ministeriale del 2 novembre 2015.
In assenza di un test sierologico "gold standard" per la ricerca di anticorpi anti-Plasmodium, l'obiettivo del presente lavoro è stato quello di testare i quattro kit ELISA disponibili in commercio nel nostro paese (DRG® Malaria, NovaLisa, Euroimmun, Dia.pro) e di confrontarne i risultati. I quattro kit ELISA sono stati utilizzati per testare: N= 43 sieri di donatori di sangue provenienti dai Centri Trasfusionali dell'azienda USL Nord-Ovest della Toscana, già testati presso il laboratorio di Parassitologia dell'Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana con il kit DRG® Malaria ELISA attualmente in uso; N=10 sieri di pazienti infetti da P. falciparum, già testati tramite immunofluorescenza indiretta (kit Falciparum-spot IF® della BioMérieux ) presso il laboratorio del Centro di Malattie Tropicali dell'Ospedale Sacro Cuore di Negrar (CMT di Negrar). La validità dei kit ELISA è stata valutata attraverso i controlli interni a ciascun kit, e attraverso una curva standard ottenuta tramite diluizione seriale di un pool di sieri iperimmuni. La specificità dei kit è stata valutata testando sieri (N=16) di pazienti infetti con Leishmania spp, Trypanosoma cruzi, Strongyloides stercoralis e Schistosoma mansoni. Mentre, per calcolare la sensibilità nei diversi kit ELISA, sono stati utilizzati i risultati di sieri di due gruppi di controlli positivi (in emoscopia N=46 e in IFAT N=56) per Plasmodium spp, analizzati presso il laboratorio del CMT di Negrar. La riproducibilità dei kit ELISA è stata valutata, testando un sottocampione di sieri in duplicato all'interno dello stesso laboratorio (N=20) e tra i due laboratori (N=10). I risultati dei kit ELISA sono stati confrontati tra di loro e con quelli del test IFAT.
I controlli interni sono risultati validi e le curve standard soddisfacenti per i quattro kit ELISA. I sieri di pazienti infetti da parassiti diversi da Plasmodium sono risultati negativi. La sensibilità è risultata variabile ed insoddisfacente, per l'emoscopia dal 45,7% al 52,2%, mentre per l’IFAT dal 51,8% al 60,7%.
Il confronto dei risultati dei quattro kit ELISA ha evidenziato una concordanza degli esiti come segue: DRG® Malaria-NovaLisa 58%; DRG® Malaria-Euroimmun 76%; DRG® Malaria-Dia.pro 84%; NovaLisa-Euroimmun 62%; NovaLisa-Dia.pro 56%; Euroimmun-Dia.pro 84%. Il coefficiente di correlazione (CV) tra gli indici (ODcampione/ODcutoff) dei campioni testati in duplicato all'interno dello stesso laboratorio è risultato maggiore della soglia del 20% nel 13% dei casi per il kit DRG® Malaria ELISA, 6% dei casi per i kit NovaLisa ed Euroimmun, e 40% dei casi per il kit DIA.PRO. La concordanza tra gli esiti (positivo/negativo) dei campioni testati in duplicato nei due laboratori è stata 80% per i kit DRG® Malaria ELISA e NovaLisa, 70% per il kit ELISA DIA.PRO e 100% per il kit Euroimmun. Non è stata osservata correlazione significativa tra gli indici ELISA e i titoli IFAT per nessuno dei kit testati.
Nonostante, i test ELISA, eseguiti con i quattro kit, siano risultati validi sulla base dei controlli interni, e specifici per anticorpi anti-Plasmodium, soltanto il kit Euroimmun ha mostrato una riproducibilità soddisfacente intra e inter-laboratorio. Nessun kit ELISA ha mostrato una correlazione significativa di risultati con quelli ottenuti tramite IFAT. Il dato più significativo dal punto di vista della medicina trasfusionale è la scarsa concordanza di risultati tra i diversi kit ELISA: lo stesso donatore potrebbe essere infatti escluso o meno dalla donazione di sangue a seconda del test utilizzato nel laboratorio di riferimento del centro trasfusionale di afferenza. Questi dati, seppur preliminari, indicano quindi come la mancanza di un test sierologico "gold standard" rappresenti un importante elemento da tenere in considerazione nell'applicazione del Decreto ministeriale del 2/11/2015.
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