• acque reflue
• patogeni enterici
• Microarray
• Real Time PCR

RIASSUNTO

Le carenze riscontrate nell’ambito dell’approvvigionamento idrico, rendono sempre più evidente l’importanza del riuso delle acque reflue per differenti fini, irrigazione di colture destinate al consumo umano, di pascoli, di parchi e aree ricreative come espresso nel D.Lgs n°152/99. E’ da considerare però fondamentale la presenza in queste acque trattate, di potenziali patogeni (batteri, virus, protozoi), responsabili di gravi infezioni a trasmissione oro-fecale. Per questo motivo l’attività di controllo delle qualità igienica dei reflui e delle pratiche di disinfezione risulta estremamente importante a prevenire la diffusione dei patogeni nei corpi idrici. E’ inoltre fondamentale controllare, non solo una generica contaminazione del liquame trattato, ma anche il rischio reale di trasmissione di malattie, sia per gli operatori del settore, sia per quanti direttamente o indirettamente, vengono in contatto con tale matrice. La normativa vigente prevede la valutazione dell’efficienza dei trattamenti degli impianti di depurazione dei reflui mediante la sola ricerca di batteri indicatori di inquinamento fecale (E. Coli e Enterococchi) e non di virus o protozoi. Ciò è dovuto principalmente alle difficoltà di rilevazione dei virus nell’ambiente e alla mancanza di metodiche innovative standardizzate adattabili a tutti i virus enterici; inoltre le tecniche utilizzate per la stessa rilevazione batterica risultano lunghe e laboriose. Le recenti innovazioni in biologia molecolare hanno facilitato la ricerca e la definizione di un quadro generale più dettagliato, permettendo inoltre di isolare ed identificare i virus direttamente dalla matrice ambientale. Tra le queste tecniche molecolari, la Real Time PCR (QPCR) rappresenta una di quelle più utilizzate e diffuse e le piattaforme multidetection, come i microarray, potrebbero rappresentare un valido aiuto alla ricerca ambientale multipla sia di batteri che di virus. La QPCR è una tecnica che misura l'amplificazione durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alle metodiche tradizionali mentre il Microarray utilizza oligonucleotidi a singolo filamento di sequenza nota per cercare una sequenza complementare (sempre a singolo filamento) in una catena molto lunga di DNA, o al limite in un genoma, opportunamente marcata dando così alta specificità al riconoscimento. In ottica della QMRA (Quantitative Microbical Risk Assenstment), la valutazione della concentrazione dei microrganismi in campioni ambientali risulta fondamentale. Su questi presupposti lo scopo della tesi è stata quella di standardizzare in laboratorio dei protocolli di QPCR e Microarray su target batterici e virali partendo da una ricerca bibliografica volta alla identificazione delle regioni del genoma più opportune sulle quali mettere appunto la metodica in relazione alla matrice in esame. I target analizzati sono stati: Adenovirus, Norovirus, HAV, Enterovirus e Rotavirus per quanto riguarda i virus e Salmonella enterica ed E.Coli O157 per i batteri. Una volta scelte le regioni con i rispettivi primer e sonde, grazie alla collaborazione del centro Nanofab-Civen di Mestre, sono stati creati degli ampliconi corrispondenti alla regione del genoma scelta, che sono stati utilizzati come standard per la misurazione della sensibilità delle metodiche. Successivamente sono stata effettuate delle prove prima su campioni interi positivi e successivamente su campioni artificialmente contaminati, questi ultimi trattati con una prima fase di concentrazione mediante ultrafiltrazione a flusso tangenziale. I dati hanno rilevato una buona efficienza e sensibilità delle due tecniche , lasciando ancora qualche dubbio sulla sensibilità della piattaforma Microarray in quanto ancora non molto alta, ma che lascia dei buoni presupposti per continuare lo studio della tecnica su tali matrici, in particolar modo per quanto riguarda la rilevazione dei virus. Questo studio ha quindi permesso di creare un sistema di quantificazione della contaminazione biologica che risulterà molto utile per la stima del rischio nei reflui che come suddetto potrebbero essere riutilizzati e quindi risulta fondamentale lo studio della loro contaminazione.


ABSTRACT

The deficiencies in water supply, make it increasingly evident the importance of wastewater reuse for different purposes, irrigation of crops intended for human consumption, pastures, parks and recreation areas as stated in Decree No. ° 152/99. It 's important, however, to consider the presence in these waters treated of potential pathogens (bacteria, viruses, protozoa), responsible for serious infections in fecal-oral route. For this reason, the control activities of the hygienic quality of the effluent and disinfection practices is extremely important to prevent the spread of pathogens in water bodies. It 's also essential to control, not only a general contamination of the sewage treated, but also the real risk of transmission of diseases, both for operators in the sector, both for those directly or indirectly, are in contact with such a matrix. The legislation provides for the evaluation of the efficiency of treatment plant wastewater treatment solely by looking for indicators of faecal pollution bacteria (E. coli and Enterococci) and not of viruses or protozoa. This is mainly due to the difficulty of detection of the virus in the environment and to the lack of standardized innovative methods adaptable to all enteric viruses; also the techniques used for the same bacterial detection are long and laborious. Recent innovations in molecular biology have facilitated the research and the development of a more detailed framework, also allowing you to isolate and identify the virus directly from the environmental matrix. Among these molecular techniques, Real Time PCR (QPCR) is one of the most used and distributed multidetection and platforms, such as microarrays, could be a valuable aid to environmental research multiple of both bacteria and viruses. The QPCR is a technique that measures the amplification during the exponential phase of PCR, that is, when the amplification efficiency is affected minimally by the variables of reaction, allowing to obtain results much more accurate compared to traditional methods while the Microarray using oligonucleotides to single filament of known sequence to search a sequence complementary (always single-stranded) in a very long chain DNA, or to the limit in a genome, suitably marked thus giving high specificity for recognition. In optical QMRA (Quantitative Risk Microbical Assenstment), the assessment of the concentration of microorganisms in environmental samples is essential. On these assumptions the purpose of the thesis has been to standardize in laboratory protocols of QPCR and Microarray of target bacterial and viral starting from a literature search time to the identification of the regions of the genome most appropriate on which precisely put the method in relation to the matrix in examination. The targets were analyzed: Adenovirus, Norovirus, HAV, Rotavirus and Enterovirus as regards viruses and Salmonella enterica and E. coli O157 for bacteria. Once chosen the regions with the respective primers and probes, thanks to the collaboration of the center Nanofab-Civen of Mestre, were created amplicon corresponding to the region of the genome chosen, which were used as standards for measuring the sensitivity of the methods. Subsequently we have been carried out on samples of tests before positive integers and subsequently on samples artificially contaminated, the latter treated with a first phase of concentration by tangential flow ultrafiltration. The data have shown good efficiency and sensitivity of the two techniques, leaving some doubt on the sensitivity of the microarray platform as yet not very high, but it leaves a good basis to continue the study of the art of these matrices, especially as on the recognition of viruses. This study thus allowed us to create a system of quantification of biological contamination that will be very useful for estimating the risk in waste that could be reused as above and then it is essential to study their contamination.