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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-07132007-171104


Tipo di tesi
Tesi di dottorato di ricerca
Autore
Raggi, Chiara
Indirizzo email
craggi@libero.it, craggi@dps.unipi.it
URN
etd-07132007-171104
Titolo
Nuovi aspetti biochimici e funzionali di due enzimi glutatione-dipendenti: γ-glutamil transferasi e glutatione transferasi omega
Settore scientifico disciplinare
MED/04
Corso di studi
MORFOLOGIA E FUNZIONE NORMALE E PATOLOGICA DI CELLULE E TESSUTI
Relatori
Relatore Prof. Casini, Alessandro
Parole chiave
  • GGT
  • glutatione
  • glutatione transferasi omega
  • GSTO
  • γ-glutamil transferasi
Data inizio appello
09/07/2007
Consultabilità
Completa
Riassunto
A) Ruolo della γ-glutamiltransferasi (GGT) nell'uptake cellulare dell'acido ascorbico. L'attivazione della GGT causa sia in sistemi in vitro acellulari che in linee tumorali con diversa attività di GGT, l'ossidazione dell'AA a DHA, insieme con la nota idrolisi del GSH; tale ossidazione viene inibita sia dal complesso serina/acido borico (SEB), inibitore competitivo della GGT, sia dalla presenza degli enzimi superossido dismutasi e catalasi nel mezzo di incubazione. In particolare la stimolazione dell'attività GGTasica nel clone 60 (linea con piu' alta attività GGT) ha come effetto principale un forte aumento dell'ossidazione dell'AA extracellulare e, contemporaneamente, un aumento significativo della concentrazione dell'AA intracellulare contrariamente al clone 21(bassa attività GGT). Incrementando l'attività GGTasica del clone 21 mediante transfezione transiente con il cDNA della GGT umana, le cellule acquisiscono una capacità di ossidare l'AA extracellulare e di aumentare i livelli intracellulari di vitamina C in maniera paragonabile a quella del clone 60. Abbiamo valutato il possibile coinvolgimento dei trasportatori GLUT nella captazione del DHA, ed la captazione di vitamina C é significativamente ridotta sia in presenza di elevate concentrazioni di glucosio, il normale substrato dei GLUT, sia in presenza di citocalasina B, inibitore non competitivo dei GLUT. Sulla base di questi dati possiamo dunque affermare che la GGT può svolgere un'azione ascorbato ossidasica nell'ambiente extracellulare, consentendo l'uptake cellulare di vitamina C sotto forma di DHA.
B) Traslocazione nucleare della GSTO1 come marker di progressione tumorale nell'Esofago di Barrett.Sono stati esaminati 46 pazienti, di questi 44 presentavano Esofago di Barrett (EB), mentre 2 mostravano un adenocarcinoma conclamato. Tra i pazienti con EB, 22/44 non mostravano displasia, 7/44 mostravano diplasia di basso grado (DBG), 9/44 displasia di alto grado (DAG). Su 6/44 non é stato possibile fare diagnosi certa di displasia e pertanto sono stati classificati come "indeterminati per la displasia". Tramite tecniche di immunoistochimica, abbiamo evidenziato la localizzazione della GSTO1 a livello della mucosa metaplastica di Barrett distinguendo localizzazione esclusivamente citoplasmatica, esclusivamente nucleare o diffusa (sia nucleare che citoplasmatica).I casi senza displasia mostravano una localizzazione prevalentemente citoplasmatica, al contrario tutti i casi con chiara displasia, sia di basso grado sia di alto grado, mostravano una localizzazione prevalentemente nucleare della GSTO. La prevalenza della localizzazione nucleare tra i casi senza displasia e quelli con diplasia é significativamente diversa (p< 0,0001).I casi non definiti per la displasia, mostravano colorazione nucleare, citosolica e diffusa. Dei 2 casi di adenocarcinoma, uno mostrava prevalente localizzazione nucleare. In conclusione questi dati ci indicano che la traslocazione nucleare della GSTO1 può essere un marker di diplasia nell'Esofago di Barrett.
C) Meccanismi d'espressione delle GSTO in linee cellulari umane.
a) Trattamento con TNFα: un'aumentata espressione della GSTO valutata tramite immunoblotting e RT-PCR ; in particolare si osserva che il trattamento con TNFα induce l'aumento del mRNA della sola GSTO1. Dato che la stimolazione con TNF-α determina l'attivazione del fattore nucleare NFkB valutata tramite EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay), esperimenti con il partenolide (inibitore di NFkB), hanno mostrato che l'inibizione dell'attivazione di NFkB blocca anche l'aumentata espressione di GSTO1 indotta dal TNF-α. Questi dati fanno pertanto supporre che il gene per la GSTO1 faccia parte del pattern di geni la cui trascrizione è regolata da NFkB.
b) Effetto dell'aumento della densità cellulare:Il modello ad alta densità è stato ottenuto tramite due diversi approcci: 1) analisi nel tempo (ogni 24 ore a partire dalla semina fino a 96 ore) di campioni con lo stesso numero iniziale di cellule; 2) analisi nel medesimo tempo, ovvero dopo 24 ore di crescita, di campioni di cellule seminate a diverse densità.Tale studio è stato condotto su una linea di melanoma umano (clone 21), un secondo clone della linea di melanoma (clone 60) e le HeLa. In tutti i casi si è osservato che ad un'aumentata densità cellulare corrisponde un notevole incremento delle GSTO valutato tramite Immunoblotting e RT-PCR. In particolare l'incremento riguarda lo mRNA sia della GSTO1 che della GSTO2, anche se la prima appare più coinvolta.
Abbiamo valutato i possibili meccanismi coinvolti nella modulazione dell'espressione di proteine da parte della densità cellulare tra cui la possibilità dell'instaurarsi delle connessioni tra cellule o tra cellule e substrato, delle variazioni del ciclo cellulare, dell'ipossia pericellulare, e della presenza di un fattore diffusibile. Ciascuno di questi casi ha dato esito negativo. Abbiamo infine voluto verificare l'ipotesi che la sovraespressione densità-dipendente delle GSTO sia dovuta a una produzione extracellulare di ROS. In esperimenti preliminari, trattando cellule HeLa ad alta densità con superossido dismutasi (SOD), si inibisce completamente la sovraespressione delle GSTO, riportandola ai valori basali osservati nelle colture a bassa densità.

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