• antimicobatterici
• High Resolution Meltin Real-Time PCR
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• resistenze

Mycobacterium tuberculosis è l’agente eziologico della tubercolosi. La terapia antibiotica ha salvato milioni di vite, tuttavia il crescente numero di isolati resistenti a uno o più farmaci rappresenta un grosso ostacolo per il controllo della malattia a livello globale. I metodi colturali sono universalmente considerati il gold standard per la determinazione dell’antimicobatteriogramma. L'uso dei test fenotipici è ostacolato dalla lenta crescita del microorganismo che comporta ritardi nell’inizio del trattamento terapeutico. L'identificazione mediante sequenziamento delle mutazioni genetiche responsabili di fenotipi resistenti ha consentito di sviluppare diverse tecniche molecolari per la rilevazione della resistenza ai farmici di prima e seconda linea con tempi di risposta molto ridotti.
Lo scopo di questo lavoro di tesi è quello di sviluppare la tecnica della High Resolution Melting Real-Time PCR (HRM) in modo da identificare e caratterizzare le resistenze a farmaci di prima linea in isolati clinici di M. tuberculosis. A tal fine, sono stati raccolti e selezionati 74 isolati risultati fenotipicamente resistenti ad almeno uno dei farmaci di prima linea quali rifampicina, isoniazide, etambutolo e pirazinamide. Nella prima parte della tesi è descritto il metodo di analisi del profilo di resistenza fenotipica dei campioni analizzati attraverso il sistema automatico “Bactec MGIT 960”. Nella seconda parte della tesi, il profilo di suscettibilità ai farmaci di prima linea dei campioni in esame è stato analizzato attraverso due differenti metodi molecolari. Il primo metodo consiste nel sequenziamento delle regioni dove sono riscontrate le mutazioni più diffuse associate alla farmaco-resistenza. Il secondo metodo consiste invece nella costruzione di un pannello diagnostico tramite la tecnica di HRM che permette di identificare mutazioni note associate a farmaco-resistenza tramite l’analisi del profilo di melting di ciascun isolato. Infine, il saggio HRM è stato poi validato attraverso l’analisi di parametri intra- (efficienza, limite di rilevazione) e inter-test (sensibilità e specificità).