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• disordini del neurosviluppo
• hiPSCs
• organoidi
• CRISPR/Cas9
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• neurodevelopmental disorders

Riassunto:
La conoscenza dei meccanismi che regolano il neurosviluppo umano, nonostante la loro rilevanza, è ancora oggi incompleta a causa delle limitazioni nello studio di embrioni umani e della divergenza strutturale e cellulare dai modelli animali. Per questi motivi, l’utilizzo di modelli in vitro basati su cellule umane è di sostanziale importanza per comprendere i meccanismi intrinseci alla base del neurosviluppo e delle sue possibili alterazioni.
Per la prevenzione o la cura di tali alterazioni, la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari è altrettanto fondamentale. Per questo motivo, nel presente lavoro di tesi proponiamo l’utilizzo di cellule pluripotenti indotte (iPS), progenitori neurali e popolazioni neurali mature derivati da cellule iPS e della tecnologia CRISPR/Cas9 per studiare le basi molecolari delle malattie genetiche del neurosviluppo umano come la microcefalia primaria (MCPH). La MCPH è una rara ed incurabile patologia con un’incidenza che varia tra 1.3 e 150/100.000 nati vivi; tali variazioni sono attribuibili alla specifica popolazione in esame e al tasso di matrimoni tra consanguinei nella stessa. Mutazioni a carico di geni relativi a proteine coinvolte nell’assemblaggio del fuso mitotico o nella regolazione del ciclo cellulare possono causare l’insorgenza della MCPH e la seconda forma più comune di questa patologia è riconducibile a mutazioni del gene WDR62 (MCPH2). WDR62 è una proteina scaffold implicata nella costituzione del fuso mitotico ed è coinvolta nella determinazione delle divisioni simmetriche o asimmetriche nei progenitori neurali durante lo sviluppo corticale.
In questo progetto di dottorato, abbiamo utilizzato cellule iPS derivanti da un paziente affetto da MCPH2. Il caso clinico presentava una mutazione in omozigosi frameshift de novo a carico di WDR62 (D955AfsX112). La delezione di 4 paia basi (ACAG) a livello dell’esone 23 di WDR62 provoca la formazione di un codone di stop prematuro e la produzione di una proteina tronca, mancante della porzione C-terminale. Allo scopo di espandere il nostro studio, abbiamo introdotto la linea di cellule iPS derivanti da uno dei genitori del soggetto affetto – eterozigote per la mutazione D955AfsX112 (Het) – e altre due mutazioni a carico di WDR62, ritrovate in pazienti affetti da microcefalia.
Inoltre, a partire dalle cellule iPS del paziente (Mut iPSCs), abbiamo generato linee di controllo isogeniche (Iso iPSCs), utilizzate come controllo gold standard. Le cellule iPS Iso e Mut sono state successivamente differenziate in cellule staminali neuroepiteliali (cellule iPS-NES) e in neuroni corticali maturi istituendo così un modello 2D in vitro della MCPH2. Inoltre, abbiamo generato un modello 3D di progenitori neurali, con lo scopo di evidenziare gli effetti della mutazione in un sistema a maggiore complessità. Per questo motivo, abbiamo generato organoidi corticali (hCOs) a partire dalle cellule iPS Iso, Het e Mut.
Le analisi di immunofluorescenza condotte sulle cellule Mut iPS e iPS-NES hanno rivelato una mis-localizzazione rispetto ai poli del fuso mitotico di WDR62 durante la mitosi. Al contrario, nelle cellule Iso iPS e iPS-NES, dove la sequenza di WDR62 è stata ripristinata tramite gene editing, la proteina risultava correttamente localizzata ai poli del fuso durante la mitosi. Allo stesso modo, nelle cellule iPS Het, WDR62 era correttamente localizzata durante la mitosi. Come conseguenza della mancata localizzazione di WDR62 nelle cellule Mut iPS-NES, abbiamo rilevato diverse alterazioni riguardanti il ciclo cellulare. Inoltre, nonostante la divergenza nella localizzazione durante la mitosi, abbiamo evidenziato che WDR62, durante l’interfase, si localizza a livello dell’apparato di Golgi sia nelle cellule Iso, che Het e Mut. Questa osservazione è stata corroborata tramite il knock down di WDR62, mediante esperimenti di misespressione di WDR62 con un tag e tramite la frammentazione dell’apparato di Golgi in ministacks, in cui il segnale di WDR62 è rilevabile tramite immunofluorescenza, localizzato nelle cisterne frammentate. Questi risultati hanno quindi dimostrato che la proteina mutata è tradotta ed è presente nelle cellule iPS e iPS-NES e che la mutazione inficia principalmente la sua localizzazione durante la mitosi – ma non durante l’interfase. Inoltre, le analisi condotte sulla localizzazione della proteina tramite mis-espressione hanno rivelato un pattern comune tra le diverse mutazioni di WDR62.
Per approfondire le nostre osservazioni in un sistema 3D di progenitori neurali, abbiamo condotto analisi di immunofluorescenza sugli Iso, Het e Mut hCOs al giorno 30 di differenziamento (DIV30). Al DIV30, gli hCOs sono principalmente costituiti da progenitori neurali assimilabili alle cellule della glia radiale (RG-like) organizzate in rosette neurali. Durante la mitosi, le cellule RG-like mantenevano il pattern di localizzazione di WDR62 osservato precedentemente: negli hCOs Iso e Het la proteina era correttamente localizzata ai poli del fuso mentre risultava mis-localizzata attorno alla cromatina nelle cellule RG-like in divisione degli hCOs Mut. Grazie agli hCOs abbiamo osservato che la co-localizzazione di WDR62 con l’apparato di Golgi avviene a livello del processo apicale delle cellule RG-like e che negli hCOs Mut, queste cellule progenitrici preferenzialmente si dividono in maniera asimmetrica, suggerendo un destino differenziativo precoce a scapito degli eventi proliferativi.
In ultimo, ci siamo chiesti quali fossero i meccanismi di traslocazione della proteina dall’apparato di Golgi ai poli del fuso mitotico. Per esplorare tale aspetto, abbiamo indotto la de-polimerizzazione dei microtubuli in cellule iPS-NES (CTRL) tramite la somministrazione di nocodazolo. Nelle cellule in mitosi trattate, WDR62 risultava assente dai poli del fuso mitotico, mimando il fenotipo osservato nelle cellule Mut iPS-NES, indicando che il meccanismo di traslocazione Golgi-poli del fuso avviene in maniera microtubulo-dipendente. Abbiamo quindi concluso che la mutazione D955AfsX112 di WDR62 impedisce l’interazione della proteina con i microtubuli e di conseguenza la sua traslocazione ai poli del fuso durante la transizione interfase-mitosi. L’alterazione di tale meccanismo si riflette negativamente sulla proliferazione dei progenitori neurali provocando i) una diminuita capacità delle cellule Mut iPS-NES di riprendere il ciclo cellulare dopo l’arresto indotto tramite somministrazione di nocodazolo; ii) la riduzione della lunghezza del ciglio primario nelle cellule Mut iPS-NES; iii) un aumento nella percentuale di divisioni asimmetriche nella popolazione RG-like negli organoidi Mut; e iv) un conseguente effetto sul corretto timing di generazione neuronale. Infatti, le analisi condotte a diversi time points durante il differenziamento diretto in senso corticale hanno evidenziato fenomeni di determinazione neuronale alterato nelle colture Mut.
Collettivamente, questi risultati evidenziano le conseguenze della mutazione di WDR62 (e possibilmente di altre mutazioni) sulla localizzazione dinamica della proteina dall’apparato di Golgi ai poli del fuso mitotico. L’alterazione dei processi di traslocazione di WDR62 e la conseguente assenza della proteina dalla sua localizzazione fisiologica durante la mitosi provocano severe conseguenze a livello dei progenitori neurali e più in generale sui processi di neurosviluppo, delineando nuovi potenziali meccanismi eziologici alla base della MCPH2.

Summary:
Mechanisms controlling human brain development, despite their relevance, are still poorly understood, given the challenges of studying human embryos and developmental divergence from animal models. Human cell-based in vitro models can be used to understand mechanisms of human brain development and its possible alterations, thereby bypassing substantial interspecies differences. Since uncovering the molecular and cellular bases of a disorder is critical to developing an evidence-based treatment, research conducted for this Ph.D. project used iPSCs, neural stem cell derivatives, and CRISPR-Cas9 technology to investigate the molecular basis of primary microcephaly (MCPH), a genetic neurodevelopmental disorder in humans. This rare and incurable pathology has a birth incidence that ranges from 1.3 to 150/100,000, depending on the population type and consanguineous marriage rate. Mutations of various genes linked to mitotic spindle assembly or cell cycle can lead to MCPH; the second most commonly affected gene is WDR62 (MCPH2), a scaffold protein localized to the spindle poles during mitosis and involved in symmetric versus asymmetric cell division choices in neural progenitors during cortical development.
In this Ph.D. project, MCPH2-patient iPSCs carrying the homozygous WDR62 D955AfsX112 de novo truncating mutation (Mut iPSCs) were used. The mutation consists of a 4 bp deletion in exon 23 of WDR62 leading to a premature stop codon, and to a C-terminus truncated protein. An iPSCs line harboring the WDR62 D955AfsX112 heterozygous mutation (from one parent) was characterized and two additional MCPH2 pathogenic mutations were assessed. Furthermore, isogenic corrected lines (Iso) from Mut iPSCs were generated as a gold standard control. Subsequently, Mut and Iso iPSCs neuroepithelial stem (iPS-NES) cells were differentiated and cerebro-cortical neurons used to establish a 2D MCPH2 in vitro model. Further, a 3D neural progenitor in vitro model generating human iPS-derived Iso, Het, and Mut cerebral organoids (hCOs) was also used.
Based on immunofluorescence, in Mut iPSCs and Mut iPS-NES cells, WDR62 failed to localize to the spindle poles during mitosis, with a diffuse pattern around chromatin, whereas localization at spindle poles was restored in Iso iPSCs and Iso iPS-NES cells. Similarly, WDR62 was correctly localized to the spindle poles during mitosis in Het iPSCs. The absence of WDR62 from spindle poles in Mut iPS-NES cells impaired mitotic progression. Conversely, during interphase, there was a novel WDR62 localization pattern, with the protein localized to the Golgi apparatus in both Mut and Iso iPS-NES cells. Several approaches were used to investigate this finding, including WDR62 signal specificity assessment through WDR62 siRNA-mediated knockdown, FLAG-tagged WDR62 mis-expression, and through Golgi apparatus fragmentation, which revealed WDR62 signal localized in the generated Golgi ministacks. Based on these results, we inferred that the mutation, leading to a C-terminus truncated peptide, did not impact WDR62 expression and protein production, and that the D955AfsX112 mutation mainly affected localization during mitosis, although its Golgi apparatus localization was maintained. Additionally, analysis in the FLAG-tagged WDR62 mis-expression system revealed a common pattern among various patient-encountered mutant forms of WDR62.
To extend and validate our findings in a 3D neural progenitor model, Iso, Het, and Mut hCOs at day in vitro 30 (DIV30) were analyzed with confocal imaging. At DIV30, in hCOs were radial glia (RG)-like neural progenitors organized into neural rosettes. In Iso and Het mitotic RG-like cells within the hCOs, WDR62 was present at spindle poles, confirming the WDR62 localization pattern we had detected in iPS-NES cells. Conversely, WDR62 was mis-localized from spindle poles and diffused around chromatin in mitotic RG-like cells in Mut hCOs. Further, WDR62 and Golgi apparatus were localized in the apical domain of the RG-like cells, an observation also validated in human fetal brain sections. RG-like cell mitotic spindle orientation was assessed with the hCO platform, revealing higher asymmetric cell divisions in Mut hCOs and indicating a premature differentiative fate.
Lastly, the mechanism translocating WDR62 from the Golgi apparatus to the spindle poles was explored. Microtubules were pharmacologically disrupted in CTRL iPS-NES cells, with a lack of WDR62 from spindle poles in mitotic cells after treatment. Therefore, we concluded that the D955AfsX112 mutation hampered the microtubule-mediated WDR62 shuttling from the Golgi apparatus to the spindle poles, causing: i) diminished capability of Mut iPS-NES cells to regain the cell cycle after drug-induced arrest; ii) shortened primary cilia in Mut iPS-NES cells; iii) an increase in percentage of asymmetric cell divisions in the population of RG-like cells in Mut hCOs; and iv) impaired neuronal generation timing as a final outcome. Indeed, during directed neocortical differentiation, there was altered neuronal generation timing leading to incorrect cell fate acquisition.
Collectively, these results documented a novel side of Golgi apparatus localization in interphase cells and consequences of the D955AfsX112 (and perhaps others) mutation on protein dynamic localization pattern. Impairment of Golgi apparatus-spindle pole shuttling caused severe neurodevelopmental abnormalities, delineating new mechanisms in MCPH2 etiology.