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Tesi etd-07042005-130754


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Damiani, Devid
email address
devid.damiani@gmail.it
URN
etd-07042005-130754
Title
Ruolo del gene Xotx2 nel mesendoderma anteriore di Xenopus laevis
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Commissione
relatore Vignali, Robert
relatore Andreazzoli, Massimiliano
Parole chiave
  • xenopus
  • Otx2
  • mesendoderma
Data inizio appello
18/07/2005;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
18/07/2045
Riassunto analitico
RIASSUNTO<br><br><br><br>Lo sviluppo dell&#39;occhio dei vertebrati richiede una complessa sequenza di induzioni planari e verticali. La prima evidenza morfologica di tale processo è visibile alla fine della neurulazione. Dalle pareti laterali del tubo neurale appena chiuso evaginano le vescicole ottiche, che con il proseguimento dello sviluppo daranno origine a retina, epitelio pigmentato e nervo ottico. Le vescicole ottiche inducono inoltre l&#39;ectoderma soprastante a diventare placode lentogeno, ovvero cristallino presuntivo. Quest’ultimo induce la vescicola ottica ad invaginarsi, formando una struttura a due strati a forma di coppa: lo strato esterno diverrà epitelio pigmentato, mentre quello interno darà origine alla retina neurale, che attraverso fenomeni di delaminazione assumerà la morfologia della retina adulta. La coppa ottica è connessa al diencefalo tramite il peduncolo ottico, che darà origine nell’adulto al nervo ottico.<br>Gli esperimenti di embriologia classica hanno chiarito come lo sviluppo dell’occhio sia determinato primariamente alla fine della gastrulazione dall’effetto di induzione verticale del mesendoderma anteriore, costituito dalla placca precordale, sull’ectoderma soprastante. Tale specificazione avviene tramite l’espressione di proteine di secrezione che hanno per lo più la funzione di antagonizzare i morfogeni, che definiscono, attraverso gradienti di concentrazione, gli assi antero-posteriore e dorso-ventrale dell’embrione. Questi fattori così in competizione con i recettori membranali degli stessi morfogeni, portando all’inibizione delle cascate di trasduzione del segnale da essi stimolate. In questo modo l’ectoderma assume la competenza a diventare placca neurale prima, vescicola ottica poi. Entrambe le vescicole ottiche, comunque, derivano da una regione impari mediana della placca neurale, che prende il nome di campo dell’occhio <br>( “eyefield” ).<br>Recentemente è stata scoperta la correlazione fra origine di tale campo morfogenetico ed inibizione di una delle più importanti cascate di trasduzione del segnale dello sviluppo dell&#39;organismo: la &#34;Wnt pathway&#34;. Gli Wnt sono proteine secrete isolate per la prima volta in topo (int-1) e in Drosophila (wingless) che hanno un&#39;azione posteriorizzante a livello della piastra neurale. Essi agiscono su dei recettori di membrana, detti Frizzled, e tramite una complessa rete di interazioni citoplasmatiche aumentano la concentrazione cellulare di beta-catenina. Questa entra nel nucleo e lega un repressore trascrizionale, la proteina LEF/TCF, convertendolo in attivatore: in questo modo viene promossa l&#39;espressione di un gran numero di geni nelle diverse fasi dello sviluppo. <br>I geni codificanti gli antagonisti secreti dalla placca precordale cominciano ad essere espressi nella gastrula precoce nella zona dell’organizzatore di Spemann. I geni Cerberus, Dkk-1, Frzb-1 e Crescent codificano per proteine che hanno propriamente la funzione di inibire la via degli Wnt, creando probabilmente un territorio di competenza per la formazione del campo dell’occhio. Tuttavia, i fattori dell’organizzatore in grado di regolare la trascrizione dei geni suddetti restano al momento sconosciuti. In tale ottica, in questo lavoro di tesi è stato preso in considerazione Xotx2, un gene materno successivamente espresso nell’organizzatore e codificante per un fattore di trascrizione, come possibile regolatore dei geni per proteine secrete dall’organizzatore.<br>A tale scopo, sono state effettuate microiniezioni di mRNA sintetizzato in vitro per il gene Xotx2 nel blastomero ventrale vegetativo di embrioni a 4 blastomeri. Gli embrioni sono stati fatti crescere fino allo stadio di gastrula precoce (st. 10+ / 10 ¼ ), fissati, emisezionati con bisturi da microdissezione a livello del labbro dorsale del blastoporo e processati per ibridazione in situ “whole mount”. In questo modo si può verificare se il trascritto iniettato sia sufficiente per far esprimere in posizione ectopica i geni presi in esame, ovvero codificanti per inibitori secreti di Wnt. Come controllo dell’attività del trascritto è stata saggiata la capacità da parte di Otx2 di inibire i movimenti di estensione convergente durante la gastrulazione e di indurre la formazione di organi adesivi supplementari. In questo modo è stato possibile osservare un’espressione ectopica del gene Dkk-1.<br>L’esperimento di perdita di funzione del gene Otx2 nel topo genera gravi mutazioni anteriori, quali l’assenza della testa. Con lo stesso scopo è stata operata in Xenopus l’iniezione di RNA codificanti per una proteina Xotx2 nella quale il dominio di transattivazione viene sostituito con il dominio di repressione della trascrizione contenuto nella proteina Engrailed. I fenotipi generati mostrano riduzioni parziali o totali del prosencefalo e, in generale, di tutte le strutture cefaliche più anteriori, occhi compresi. Nel nostro caso il costrutto “Engrailed-repressor” è stato microiniettato nel blastomero vegetativo dorsale, in modo da indirizzare il trascritto nel futuro territorio dell’organizzatore. Ne è risultata una abolizione praticamente totale dell&#39;espressione normale del gene Dkk-1. Il gene Xotx2 è risultato quindi necessario e sufficiente a dirigere l’espressione del gene Dkk-1, il quale, da dati presenti in letteratura, è capace peraltro di dirigere lo sviluppo della placca precordale.<br>Sono tuttora in corso esperimenti per mettere in luce la precisa funzione mesendodermica del gene Xotx2 attraverso l&#39;osservazione fenotipica di embrioni iniettati.<br>Questi dati gettano nuova luce su un possibile meccanismo di induzione verticale attraverso il quale Xotx2 può portare alla specificazione dell’ ”eyefield” nella placca neurale anteriore.<br><br>
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