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Tesi etd-07032006-103414


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
Romano', Ulisse
email address
vuelvoalsur@hotmail.com
URN
etd-07032006-103414
Title
Regolazione durante lo sviluppo dell'acetilazione dell'istone H3 in corteccia visiva in seguito ad esperienza visiva
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
NEUROBIOLOGIA
Supervisors
Relatore Pizzorusso, Tommaso
Parole chiave
  • ERK
  • CREB
  • plasticità sinaptica
  • acetilazione H3
Data inizio appello
20/07/2006;
Consultabilità
Completa
Riassunto analitico
Gli studi realizzati negli ultimi anni atti ad indagare e descrivere i meccanismi molecolari coinvolti nel fenomeno della plasticità sinaptica hanno evidenziato l’importanza della via di ERK.
Affinché l’esperienza possa regolare le modificazioni morfologico-funzionali dei neuroni è necessaria l’attivazione di vie che in risposta ad un aumento dell’attività neuronale producano come effetto la trascrizione di specifici programmi genici. Tale necessità è soddisfatta dalla via di ERK..
Questa via, attraverso una complessa rete di chinasi, induce l’attivazione del fattore di trascrizione CREB e del coattivatore CBP.
Gli studi svolti su CREB e le sue modalità d’attivazione hanno altresì evidenziato il ruolo del rimodellamento della cromatina nel fenomeno della plasticità e, in particolare, dell’acetilazione degli istoni, che di questo rimodellamento è un passaggio fondamentale.
Oggetti della mia tesi sono: lo studio dello stato d’acetilazione della cromatina nel topo adulto e durante il periodo critico e l’analisi degli effetti prodotti dall’aumento dello stato di acetilazione dell’istone H3 (indotto sperimentalmente) sull’attivazione dell’espressione genica mediata dal CREB nel topo adulto.
Considerato che l’attivazione dell’espressione genica è condizione necessaria per il ripristino dei livelli di plasticità sinaptica presenti durante il periodo critico in individui adulti, scopo di questo lavoro è dimostrare che l’acetilazione dell’istone H3, e il conseguente rimodellamento della cromatina, è una condizione sufficiente a determinare l’aumento dei livelli di plasticità in corteccia visiva.
Il primo passo è stato indagare il livello dell’acetilazione degli istoni, indotto dall’esperienza visiva nell’omonima area corticale, in animali adulti e durante il periodo critico.
Abbiamo utilizzato animali wild-type sottoposti a cicli di stimolazione visiva variabile (60 ore di buio e 0, 40 o 90 minuti di luce) e misurato l’acetilazione dell’istone H3 mediante western blot.
I risultati indicano un’attivazione dell’acetilazione dell’ H3 nell’animale in sviluppo proporzionale alla durata dell’esperienza visiva. Tale attivazione appare dipendere dalla via di ERK, la cui inibizione provoca una vistosa riduzione dell’acetilazione degli istoni.
Nell’adulto non vi è induzione dell’acetilazione dell’istone H3 esperienza-dipendente; i livelli d’acetilazione dell’ H3 non sono infatti diversi negli individui stimolati e negli individui non stimolati visivamente (controllo).
A questo punto abbiamo voluto osservare a quali risultati portasse l’induzione sperimentale dell’acetilazione degli istoni per mezzo della tricostatina A (TSA), in termini di espressione genica.
Il protocollo prevede l’utilizzo di topi adulti (>p70) transgenici che esprimono il gene LacZ sotto il controllo esclusivo di un promotore contenente sequenze CRE alle quali si lega in modo specifico il fattore di trascrizione CREB.
Ai topi transgenici viene iniettata, in una regione anteriore alla corteccia visiva di uno solo dei due emisferi, una soluzione di TSA (tricostatina A 1µl/1ml); successivamente gli animali vengono sottoposti ad un ciclo di 60 ore di buio e 12 ore di luce al termine del quale vengono uccisi e i cervelli asportati.
Al fine di valutare l'avvenuta attivazione del gene reporter in seguito alla stimolazione visiva e all'acetilazione degli istoni indotta dalla somministrazione di TSA, abbiamo compiuto un saggio istochimico sui cervelli asportati degli animali sperimentali; il prodotto dell'espressione del gene LacZ è la b-galattosidasi, una proteina che metabolizza l’ X-gal, agente utilizzato nella reazione istochimica, causando la colorazione della cellula, che diventa blu.
Infine abbiamo misurato il numero di cellule esprimenti la b-galattosidasi; il confronto dei dati ottenuti nelle due cortecce rappresenta il risultato del nostro lavoro.
I risultati indicano che tanto macroscopicamente quanto microscopicamente appare evidente un’attivazione dell’espressione del gene reporter maggiore nelle cortecce trattate con TSA che nelle cortecce non trattate o trattate con solo veicolo.
Il dato è confermato dall’analisi della corteccia visiva ma anche di regioni non visive della corteccia, a dimostrazione del fatto che la trascrizione genica è imputabile, forse, al semplice effetto farmacologico della TSA e non è indotta necessariamente dall’esperienza visiva.
Nel loro insieme i dati suggeriscono che la modulazione dell’acetilazione dell’istone H3 è un elemento sufficiente a modificare lo stato d’espressione dei geni coinvolti nei fenomeni di plasticità in corteccia visiva e che una delle variazioni che determina la minore plasticità dell’adulto possa essere la riduzione dei livelli di acetilazione degli istoni rispetto al periodo critico.


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