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I geni della famiglia Otx dei vertebrati sono omologhi di orthodenticle (otd) di Drosophila melanogaster, e codificano per fattori di trascrizione dotati di un omeodominio del tipo di paired-like K50.
I geni otd/Otx sono espressi durante lo sviluppo di diversi organismi modello a partire da stadi embrionali precoci, in particolare nel sistema nervoso anteriore, negli organi di senso e nel cordomesoderma anteriore.
Durante la mia tesi mi sono occupato di produrre dei costrutti mutanti di alcuni geni Xotx di Xenopus laevis, allo scopo testare, mediante successivi saggi di sovra-espressione in embrioni di Xenopus, il ruolo di specifiche regioni delle rispettive proteine sulla loro specificità d’azione. I geni presi in considerazione sono Xotx1, Xotx2, e Xotx5b, che mostrano nei saggi funzionali notevoli somiglianze, ma anche differenze negli effetti delle microiniezioni dei rispettivi mRNA. Tutti e tre, infatti, inibiscono l’estensione convergente durante la gastrulazione, caratteristica delle regioni posteriori dell’embrione. Solo Xotx2 e Xotx5b, e non Xotx1, inducono la ghiandola del cemento, una struttura secernente muco situata nell’ectoderma anteriore degli embrioni degli anfibi, che ha la funzione di ancorarli al substrato. Le proteine XOTX1, XOTX2 e XOTX5b presentano un’alta omologia di sequenza, ma XOTX1 contiene in più una regione ricca in serine e una ricca in istidine, entrambe a valle dell’omeodominio; si può quindi ipotizzare che una di queste regioni o entrambe siano responsabili della diversa attività di XOTX1 rispetto alle altre due proteine nell’induzione della ghiandola del cemento.
Per verificare questa ipotesi sono stati preparati due costrutti swap domain a partire delle regioni codificanti dei geni wild-type Xotx1 e Xotx5b, in cui l’N-terminale di Xotx1, compreso l’omeodominio, è stato fuso al C-terminale di Xotx5b e viceversa, per verificare che siano i C-terminali e non gli N-terminali i responsabili delle differenze nei fenotipi; sono stati inoltre generati due costrutti di Xotx1 deleto di ciascuna delle due regioni ricche in Ser e His e il costrutto doppio deleto di entrambe queste regioni. Per ottenere i cinque costrutti sono stati introdotti siti di restrizione in posizioni opportune tramite mutagenesi sito-diretta. I costrutti definitivi sono stati ottenuti mediante digestioni enzimatiche e ligation opportune. Successivamente sono stati sintetizzati in vitro gli mRNA corrispondenti, ed in parallelo quelli di Xotx1 e Xotx5b wild-type come controlli.
Sono quindi stati effettuati esperimenti di iniezione degli mRNA così generati nel polo animale degli embrioni allo stadio di 4 cellule, in un blastomero presuntivo dorsale o ventrale. È stato quindi possibile fare un confronto tra i risultati ottenuti dalla sovraespressione dei geni wild-type Xotx1 e Xotx5b con quelli ottenuti dall’iniezione dei nostri costrutti mutanti. Gli embrioni iniettati, una volta fissati a uno stadio adeguato per lo sviluppo della ghiandola del cemento, sono stati sottoposti a analisi molecolare tramite ibridazione in situ whole mount per il gene marcatore Xag, che marca le ghiandole del cemento e la ghiandola della schiusa, come diagnosi più affidabile di un semplice esame morfologico. Questi esperimenti hanno permesso di stabilire che la regione His-rich è responsabile dell’incapacità di Xotx1 di indurre la ghiandola del cemento, mentre la Ser-rich non sembra avere alcun ruolo in questo processo. Esperimenti condotti su animal cap, espiantati da embrioni iniettati con i diversi costrutti, hanno ampiamente confermato tale risultato.