• nitrificazione
• denitrificazione
• Nitrospira
• MBR
• CAS

Durante i mesi di giugno e luglio 2008 sono stati effettuati campionamenti da due reattori sperimentali deputati alla rimozione di azoto presenti all’interno dell’impianto consorzio “CUOIODEPUR” presso San Romano (PI). Essi erano alimentati con refluo civile ed i campioni sono stati prelevati dalla vasca di ossidazione-nitrificazione. I due reattori, denominati “CAS” ed “MBR”, rappresentano, rispettivamente, un impianto tradizionale a fanghi attivi ed un reattore biologico a membrana. Scopo della tesi è stato di caratterizzare e confrontare tra loro le due comunità microbiche presenti in ciascun reattore in condizioni di stabilità.
Per ciascun reattore sperimentale sono state allestite due libraries del gene codificante per il 16S rRNA ciascuna delle quali è stata costruita con diverse coppie di primers batterici universali (F7-R1492 ed F7-R1390). Successivamente è stato eseguito lo screening delle libraries mediante RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Cloni rappresentativi per ogni pattern individuato sono stati sequenziati; l’affiliazione delle sequenze ottenute è stata verificata sia tramite NCBI blast, sia mediante l’utilizzo del pacchetto ARB (Ludwig et al. 2004), un programma per analisi filogenetica comparativa di sequenze. Sono stati inoltre effettuati esperimenti di ibridazione in situ (FISH) con sonde fluorescenti specifiche per i principali gruppi di batteri individuati dallo screening delle libraries . In questo modo si è verificata l’effettiva presenza nel campione degli organismi evidenziati dall’analisi delle libraries, valutandone la prevalenza effettiva.
I risultati dello screening delle libraries mostrano che la componente microbica all’interno di ciascuno dei due reattori sperimentali è molto eterogenea. Nel reattore MBR sono state osservate percentuali piuttosto significative (superiori al 10% rispetto al totale dei cloni analizzati) relative ai phyla dei Proteobacteria, Bacteroidetes e Nitrospira. Per quanto riguarda l’impianto CAS, una percentuale significativa di batteri risulta appartenere al phylum dei Planctomycetales (rispettivamente 20,98% e 18,36% in ciascuna library). Altro phylum fortemente rappresentato nel reattore CAS è quello dei Chlorobi (3,7% e 18,36%); si riscontrano inoltre percentuali superiori al 10% anche per il phylum Proteobacteria (45,71% e 48%). In particolare, tutti i batteri di entrambe le comunità microbiche appartenenti al phylum Nitrospira, risultano appartenere al genere Nitrospira (batteri nitrito ossidanti); nel reattore MBR la percentuale di sequenze affiliate a questo gruppo di batteri è decisamente maggiore (15,0% e 9,7% a fronte del 2,47% e 4,08% nell’impianto CAS). Questo risultato è in accordo con il fatto che in un bioreattore a membrana in cui il tempo di permanenza del fango è maggiore, è favorito lo sviluppo di batteri specializzati nella rimozione dell’azoto caratterizzati da tempi di crescita più lunghi. Da sottolineare il fatto che le nitrospire individuate all’interno dell’impianto CAS sono affini alla specie N. defluvii mentre le nitrospire individuate all’interno del reattore MBR sono affini alla specie N. moscoviensis.
Risultati preliminari dagli esperimenti di ibridazione in situ confermano la presenza di batteri appartenenti ai principali gruppi individuati dallo screening delle libraries.
Gli esperimenti preliminari di FISH evidenziano la presenza di microrganismi ammonio ossidanti appartenenti al gruppo dei Beta-proteobacteria per i quali è stata utilizzata una sonda specifica (4% circa in entrambi i reattori). La presenza di questi microrganismi non è stata documentata dallo screening delle libraries; in ogni caso, tali microrganismi potrebbero non essere gli unici responsabili dell’ossidazione dell’ammonio. Inoltre, l’utilizzo della sonda specifica per i batteri del phylum Nitrospira, ha confermato i dati ottenuti dallo screening mettendo in evidenza che tale gruppo è maggiormente rappresentato nel campione prelevato dal reattore MBR (24,13%) rispetto al campione proveniente dal CAS (5,11%).
I risultati ottenuti dimostrano quindi che le due comunità microbiche sono eterogenee; in particolare si differenziano nella presenza di diversi phyla batterici e nella loro rappresentanza relativa. I risultati delle libraries unitamente a quelli della FISH hanno evidenziato la presenza sia di batteri ammonio ossidanti che nitrito ossidanti.