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• sottotipi virali HHV-8
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Il virus erpetico umano 8 (HHV-8), denominato anche herpesvirus umano associato al sarcoma di Kaposi (KSHV), è l’agente eziologico del sarcoma di Kaposi (KS), una neoplasia angioproliferativa e di due rari disordini linfoproliferativi: il linfoma ad effusione primaria (PEL/BCBL) e la malattia di Castleman (MCD).
HHV-8 può essere trasmesso: per contatto diretto (sessuale, saliva), per via iatrogena (trasfusione, trapianto d’organo, puntura con aghi infetti), raramente per via verticale da madre a feto o attraverso il latte materno.
Esistono 4 varianti del KS: endemica, iatrogena, epidemica, cronica o classica, caratterizzate da vari gradi di aggressività, di incidenza a seconda del sesso, dell’età e della distribuzione geografica.
L’analisi filogenetico-epidemiologica della regione ipervariabile ORFK1 del genoma virale ha identificato 5 genotipi di HHV-8 (A, B, C, D, E) che sono stati associati ad una diversa prevalenza geografica; solo recentemente il sottotipo A è stato correlato ad una forma più aggressiva del KS classico.
In uno studio recente abbiamo ha eseguito la quantificazione della carica virale e la tipizzazione dei ceppi virali infettanti in campioni di sangue e saliva di 30 pazienti affetti KS classico, tutti residenti nell’area di Sassari. I risultati hanno rivelato che la carica virale nella saliva si è significativamente superiore rispetto a quella nel sangue solo nei pazienti affetti dal ceppo A e l’assenza di correlazione tra la carica virale nella saliva e nel sangue. Abbiamo inoltre osservato che inoltre che solo l’andamento degli anticorpi anti-LANA correla con l’andamento clinico della malattia, che l’andamento della carica virale in saliva è inversamente proporzionale a quella nel sangue e nel siero e che un aumento della replicazione virale nel cavo orale è associata ad un miglioramento delle condizioni cliniche del paziente e soprattutto che il ceppo A sembra presentare un maggiore tropismo per le cellule di origine epiteliale rispetto al ceppo C.
Al fine di verificare il maggiore tropismo del ceppo A per il citotipo epiteliale, scopi del presente lavoro di tesi sono stati:

1. l’analisi in vitro del tropismo cellulare dei ceppi A e C di HHV-8,
2. l’analisi in colture cellulari linfoidi ed epiteliali infettate con i sottotipi A1 e C3 di HHV-8 dei pattern di espressione dei geni cellulari umani coinvolti nel processo infiammatorio.

La replicazione virale è stata riattivata mediante trattamento con forbolo estere (TPA) in due linee cellulari: linfoma cavitario a cellule B (BCBL1) e linfoma cavitario (BC3), per ottenere rispettivamente il sottotipo A1 (BCBL1/A1) e C3 (BC3/C3) di HHV-8.
Il virus rilasciato nel surnatante, concentrato e purificato è stato utilizzato per infettare due linee cellulari umane: “human embrionic kidney” (HEK293) ed linfoblasti primari umani (PBMC).
I saggi di immunofluorescenza (IFA) e Real-Time PCR, utilizzati per analizzare il tasso replicativo e il grado di espressione antigenica virale nelle colture cellulari infettate, hanno rilevato che il sottotipo A1 sembra infettare le cellule di origine epiteliale con maggiore efficienza.
Si è quindi ipotizzato che la diversa efficienza di infezione dei due ceppi virali si potesse tradurre in una diversa modulazione dell’espressione dei geni cellulari.
Poiché l’infiammazione è alla base della patogenesi virale e può essere indotta sia direttamente dal virus che dalla cellula in reazione all’infezione, è stato valutato il pattern di espressione dei geni cellulari coinvolti in questo processo nelle colture cellulari epiteliale e linfoide infettate con i due ceppi. Il cDNA delle colture cellulari, ottenuto dall’mRNA tramite RT-PCR con random esameri e nucleotidi biotinilati, è stato ibridato su DualChip® Microarray contenenti una serie di sonde rappresentative di 297 geni umani coinvolti in 65 pathway associati al processo infiammatorio.
Il segnale rilevato a livello di ciascuno spot dei Dualchip delle linee cellulari infettate e non, è stato ripulito dal segnale di background, normalizzato e confrontato:

A) BCBL1/A1 infettante HEK293.
B) BCBL1/A1 infettante PBMC.
C) BC3/C3 infettante HEK293.
D) BC3/C3 infettante PBMC.

L’espressione genica è risultata alterata in modo statisticamente significativo rispettivamente per 169 geni nel pannello A), 104 geni nel pannello B), 131 geni nel pannello C) e 93 geni nel pannello D) e 93. Il confronto del segnale di espressione tra il pannello A) e C), e tra B) e D). Nel pannello A) i geni che sono risultati maggiormente modulati sono coinvolti nel pathway delle MAPK, del ciclo cellulare e della regolazione del actina citoscheletrica.
Analizzando il totale dei geni modulati nelle due linee cellulari infettate con entrambe i ceppi, 11 geni sono risultati comunemente modulati.
Proponiamo quindi che il silenziamento degli 11 geni modulati da entrambe i ceppi in entrambe le linee cellulari infettate, potrebbe inibire l’infezione litica di HHV-8 e le sue conseguenze cliniche.