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Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-07022008-224559


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
LAZZARI, ELISA
URN
etd-07022008-224559
Titolo
Struttura e funzione della 5'-nucleotidasi citosolica (cN-II): costruzione e caratterizzazione dei mutanti sito-specifici M436W e F127E
Dipartimento
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Relatori
Relatore Prof.ssa Tozzi, Maria Grazia
Parole chiave
  • cN-II
  • metabolismo nucleotidi purinici
  • mutagenesi
  • nucleotidasi
  • sito effettore
Data inizio appello
21/07/2008
Consultabilità
Completa
Riassunto
La 5’ nucleotidasi citosolica II (cN-II, EC 3.1.3.5) è un enzima ubiquitario appartenente alla famiglia di proteine enzimatiche coinvolte nel metabolismo dei nucleotidi, ciascuna caratterizzata da una particolare collocazione cellulare, specificità di substrato e regolazione. La cN-II è una forma solubile presente nel citoplasma (l’espressione è maggiore in cellule che presentano attiva sintesi di DNA e/o un elevato turnover degli acidi nucleici e dei loro precursori) che agisce specificatamente su (d)IMP e (d)GMP. L’enzima appartiene alla superfamiglia HAD (Haloacid Dehalogenase) e può avere una duplice attività: la reazione catalizzata procede infatti tramite la formazione di un intermedio enzima-fosfato il quale può cedere il gruppo fosfato ad una molecola di acqua (attività nucleotidasica) o ad un nucleoside (attività fosfotransferasica). La regolazione dell’attività enzimatica è molto complessa: l’enzima viene infatti attivato da 2,3-BPG, ATP, ADP e diadenosina polifosfati (in particolare Ap4A), mentre il fosfato inorganico (Pi) è un inibitore; la cN-II richiede inoltre cationi metallici bivalenti (preferibilmente Mg2+) per esplicare la sua attività.
Il coinvolgimento della cN-II nel metabolismo dei nucleotidi la rende importante anche da un punto di vista clinico: l’enzima potrebbe infatti essere coinvolto nella fosforilazione (e quindi attivazione) di alcuni analoghi dei nucleotidi utilizzati per terapie antivirali o anticancro, favorendone l’efficacia terapeutica. D’altro canto, è stato dimostrato che l’attività nucleotidasica svolta dalla cN-II su tali farmaci attivati da chinasi cellulari rappresenta invece un meccanismo di resistenza alle terapie con analoghi dei nucleotidi: lo studio dell’attività e della regolazione della cN-II potrebbe fornire quindi informazioni utili per l’ottimizzazione di cure che prevedano l’utilizzo di analoghi nucleotidici in malattie virali o tumorali.
La cN-II attiva viene purificata sotto forma di omotetramero formato da 4 subunità organizzate in due dimeri identici. Ciascuna subunità contiene il sito attivo (sede dove avviene la reazione) e due siti regolatori (denominati sito effettore 1 e 2) ai quali si legano le molecole regolatorie capaci di influenzare il grado di attività della proteina enzimatica. Studi cristallografici hanno permesso di localizzare tali siti all’interno della struttura proteica tridimensionale. Dall’osservazione della struttura cristallografica è stata formulata l’ipotesi che nel sito effettore 1 (in corrispondenza dell’interfaccia A posta tra le due subunità che compongono un dimero) possano legarsi diadenosina tetrafosfato (Ap4A) o 2,3-BPG in modo tale da influenzare il grado di associazione tra le subunità che compongono il tetrametro della cN-II, suggerendo quindi come questo possa essere un meccanismo utilizzato per la regolazione dell’attività enzimatica. Nel sito effettore 2 potrebbe invece avvenire il legame di un nucleotide adenilico con probabili funzioni regolatorie.
In questo lavoro viene presentato lo studio delle caratteristiche cinetiche relative ai mutanti sito-specifici M436W e F127E (mutanti nel sito effettore 2). I mutanti sono stati ottenuti con il metodo della PCR mutagenica operata sulla sequenza della cN-II bovina contenuta all’interno del plasmide pET-28c. Le proteine ricombinanti purificate sono state analizzate con metodo radiochimico per valutare l’effetto delle mutazioni inserite sul sito attivo ed identificare eventuali variazioni nell’interazione con le molecole effettrici.
Entrambe le mutazioni inserite non influenzano il sito attivo dell’enzima, come dimostrato dai valori dei parametri relativi ai substrati della reazione nucleotidasica (Km IMP) e fosfotransferasica (Km Ino) che risultano paragonabili a quelli osservati per l’enzima wild type. Anche il valore della K50 per il cofattore Mg2+ (contenuto all’interno del sito attivo dell’enzima) non varia nei due mutanti rispetto alla proteina wild type, confermando così che le mutazioni del sito effettore 2 non provocano modificazioni nel sito catalitico.
È risultato invece un aumento di circa 10 volte della K50 per l’attivatore Ap4A per il mutante M436W, sul quale l’attivatore ha un effetto di attivazione triplo rispetto a quanto osservato per la proteina wild type. Entrambi i mutanti non presentano differenze con l’enzima wild type nei valori di K50 per gli effettori ADP e ATP, ma in quest’ultimo caso la curva della velocità della reazione enzimatica in funzione della concentrazione di ATP ha un andamento sigmoide, sia per il mutante M436W che per il mutante F127E. Questo suggerisce quindi un tipo di legame cooperativo dell’ATP con entrambe le proteine mutate.
I risultati ottenuti permettono di ipotizzare che il sito effettore 2 oggetto di questo studio sia il sito di legame specifico per l’ATP, in quanto i parametri relativi all’ADP non vengono modificati per nessuno dei due mutanti. Il fatto che per uno dei due mutanti (M436W) si osservi anche un aumento significativo della K50 per l’Ap4A potrebbe indicare che l’analogia strutturale tra le due molecole potrebbe renderle intercambiabili all’interno dello stesso sito effettore, suggerendo inoltre che la porzione della molecola effettrice riconosciuta dalla tasca di legame proteica potrebbe essere proprio la catena di polifosfato, rendendo quindi la sua lunghezza l’elemento discriminante.
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