• bone substitute
• co-culture.
• differentiation
• endothelial
• histochemistry
• HUVEC
• MSC
• osteogenic
• pre-generated matrix
• Scaffold
• SEM

Culture and differentiation of human mesenchymal stromal cells and human endothelial cells on polymeric scaffolds to improve bone tissue engineered substitutes

Abstract
The purpose of this thesis is the development of a new strategy to improve the bone substitutes obtained via tissue engineering. These substitutes are usually achieved by culturing in vitro mesenchymal stromal cells (MSCs) and differentiating into osteogenic lineage the MSCs grown on three-dimensional porous structures made of biocompatible materials, known as scaffolds. One of the problems still to be solved is that these in vitro generated substitutes must be vascularized in vivo after implantation. Post-implant vascularization is often inadequate and leads to death of the transplanted cells. In this thesis several methods were tested to develop in vitro bone substitutes already provided with an initial vascularization. Spongy scaffolds made of polyvinyl alcohol (PVA) and gelatin (G) were tested with different weight compositions of the two polymers (namely PVA/G 100/0, 90/10, 80/20, 70/30, 50/50).
The experimental work is articulated in the following phases:
1) Cross-linking of the scaffolds with glutaraldehyde to have the polymeric structures stabilized inside an aqueous environment. The morphology of the sponges was observed with a scanning electron microscope (SEM) and their stability tested by immersion in water for two weeks.
2) Selection of the type of scaffold for the culture and differentiation of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), as an endothelial cell model. The scaffolds were cultured for 3 days and the differentiation induced by addition of Matrigel® for 18 hours. Before completing these experiments and securing the constructs in formalin, the non-destructive viability test AlamarBlue® it was performed to evaluate the metabolic activity of the cells. The fixed samples were processed for histological analysis with hematoxylin and eosin. The results showed that the scaffolds PVA/G 80/20 were the best about viability and cell colonization.
3) Selection of the type of scaffold for culturing and osteo-differentiation of human MSCs. The MSC/scaffold constructs were cultured for 22 days and the differentiation induced by addition of ascorbic acid, dexamethasone and β-glycerophosphate for 21 days. Every week the vitality test AlamarBlue® was performed. The samples were fixed in formalin and processed for histological analysis with hematoxylin and eosin to assess cell morphology and von Kossa to assess the formation of mineral matrix. The results showed that the scaffold types PVA/G 80/20 and 70/30 were the best suitable. Therefore, PVA/G 80/20 was chosen to perform the co-culture with HUVECs.
4) The co-culture was conducted for 3 days by adding, at the end of osteogenic differentiation (day 22), HUVECs to MSC/scaffold constructs, both in the presence and absence of Matrigel®. The constructs were fixed in formalin and processed for an extensive histological analysis. Immunohistochemistry analyses of endothelial and osteogenic markers were performed, in order to localize the two different cell types on the scaffold and understand their interaction.
5) In order to investigate the influence played by bone extracellular matrix alone on the differentiation of HUVECs, which in vitro needs Matrigel® to form the tubes, some MSC/scaffold constructs at the end of the osteogenic differentiation, were lysed with sterile distilled water so as to remove the cellular component and to observe the interaction of the HUVECs with the pre-generated bone matrix. An extensive histological analysis was carried out. The results of points 4) and 5) finally highlighted the importance of osteoblast-endothelial cell interaction for endothelial differentiation.
6) We finally tested this co-culture system under a completely autologous approach. To this purpose we used mesodermal progenitor cells (MPCs), which are a subset of highly immature stem cells present in the bone marrow and capable of differentiating into both MSCs and pre-endothelial cells. The expression of some osteogenic and endothelial markers in the construct confirmed results reported in literature and the scaffold PVA/G strategy can be used to explore the use of innovative techniques in bone tissue engineering.


Coltura e differenziamento di cellule stromali mesenchimali umane e cellule endoteliali umane su scaffold polimerici per migliorare i sostituti ossei ingegnerizzati

Riassunto

Lo scopo di questo lavoro di tesi consiste nella messa a punto di una nuova strategia per migliorare I sostituti ossei ottenuti tramite ingegneria tissutale. Tali sostituti generalmente si ottengono coltivando in vitro le cellule stromali mesenchimali (MSCs) e differenziandole in senso osteogenico su scaffold, ossia strutture porose tridimensionali a base di materiali biocompatibili. Uno dei problemi ancora da risolvere è che questi sostituti generati in vitro dovranno essere vascolarizzati in vivo dopo l’impianto. Questo processo è spesso inadeguato e porta alla morte delle cellule trapiantate. In questa tesi sono stati testati alcuni metodi per sviluppare in vitro dei sostituti ossei già dotati di una iniziale vascolarizzazione. Come scaffold sono state utilizzate spugne di alcool polivinilico (PVA) e gelatina, con varia composizione ponderale dei due polimeri (PVA/G 100/0, 90/10, 80/20, 70/30, 50/50). Il lavoro di tesi si è articolato nelle seguenti fasi:
1) Reticolazione degli scaffold con glutaraldeide per stabilizzare le strutture polimeriche in ambiente acquoso. La morfologia delle spugne è stata osservata al microscopio elettronico a scansione (SEM) e la loro stabilità testata tramite immersione in acqua per due settimane.
2) Selezione delle tipologie di scaffold per la coltura ed il differenziamento delle human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), come modello di cellule endoteliali. Gli scaffold sono stati coltivati per 3 giorni ed il differenziamento indotto tramite aggiunta di Matrigel® per 18 ore. Prima di terminare gli esperimenti e fissare i costrutti in formalina è stato eseguito il test di vitalità non distruttivo AlamarBlue® che valuta l’attività metabolica delle cellule. I campioni fissati sono stati processati per l’analisi istologica con Ematossilina ed Eosina. I risultati hanno evidenziato che gli scaffold PVA/G 80/20 erano i migliori.
3) Selezione delle tipologie di scaffold per la coltura ed il differenziamento osteogenico delle MSC umane (MSC).Gli scaffold sono stati coltivati per 22 giorni ed il differenziamento indotto tramite aggiunta di acido ascorbico, desametasone e β-glicerofosfato per 21 giorni. Ogni settimana è stato eseguito il test di vitalità AlamarBlue®. I campioni sono stati fissati in formalina e processati per l’analisi istologica con Ematossilina ed Eosina e von Kossa, per valutare la formazione di matrice minerale. I risultati hanno evidenziato che gli scaffold PVA/G 80/20 e 70/30 erano i migliori. Sono stati quindi selezionati gli scaffold PVA/G 80/20 per effettuare la co-coltura con le HUVEC.
4) La co-coltura è stata condotta per 3 giorni aggiungendo, al termine del differenziamento osteogenico (giorno 22), le HUVEC ai costrutti MSC/scaffold, sia in presenza che in assenza di Matrigel®. I costrutti sono stati fissati in formalina e processati per l’analisi istologica approfondita. L’immunoistochimica è stata fatta per valutare i marcatori endoteliali ed osteogenici, in modo da localizzare le due diverse tipologie cellulari sugli scaffold e capirne l’interazione.
5) Nel prosieguo del lavoro abbiamo voluto anche indagare l’influenza che la matrice extracellulare ossea da sola può giocare sul differenziamento delle HUVEC, le quali nella coltura in vitro necessitano del Matrigel® per formare i tubi. Per questa indagine, alcuni costrutti MSC/scaffold al termine del differenziamento osteogenico, sono stati lisati con acqua distillata sterile in modo da rimuovere la componente cellulare e poter osservare l’interazione delle HUVEC con la matrice ossea pregenerata. E’ stata condotta un’approfondita analisi istologica I risultati dei punti 4) e 5) hanno infine evidenziato l’importanza dell’interazione tra cellule endoteliali ed osteoblasti per il differenziamento endoteliale.
6) Abbiamo infine testato questo sistema di co-coltura con un approccio completamente autologo. A questo scopo abbiamo utilizzato cellule progenitrici mesodermiche (MPC), che sono un sotto popolazione di cellule staminali altamente immature presenti nel midollo osseo e capaci di differenziarsi sia in MSC che in cellule pre-endoteliali. L'espressione di alcuni marcatori osteogenici ed endoteliali nel costrutto hanno confermato i risultati riportati in letteratura e lo scaffold PVA/G può essere utilizzato come strategia per esplorare l'uso di tecniche innovative nella ingegneria del tessuto osseo.